枸骨中芦丁和槲皮素含量测定＊

李艳芝 姜静静

（济宁医学院药学院，山东 日照276826）

枸骨（Ilex cornuta Lindl．et Paxt．）为冬青科冬青属植物［1］，其叶、果实和根均可药用，传统入药部位为叶，为苦丁茶来源之一［2］，是预防动脉粥样硬化及减肥的良好饮品［3］。黄酮类化合物为枸骨中主要有效成分［4－5］，测定其含量可作为评价枸骨质量的依据。本文采用反相高效液相色谱法测定了枸骨不同部位及不同采收期枸骨叶中芦丁和槲皮素含量，为枸骨的质量控制及合理采收提供科学依据。

1 材料

1．1 仪器

岛津LC－20A高效液相色谱仪；LC－20AT泵；SIL－20A 自 动 进 样 器；SPD－M20A 检 测 器；CTo－20AC柱恒温箱控制器；LC Solution工作站；SYZ－550石英亚沸高纯水蒸馏器（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂生产）；LD－02型二两装高速中药粉碎机﹙中国温岭市大海药材器械厂﹚。

1．2 试剂与药品

枸骨样品采自山东日照，经济宁医学院中药学教研室鉴定为冬青科冬青属植物枸骨，自然阴干，备用；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号100080－200707）；槲皮素对照品（南昌贝塔生物科技有限公司，供含量测定用，批号10199－081219）；甲醇为色谱纯，水为二次蒸馏水，其他试剂为分析纯。

2 含量测定

2．1 色谱条件

C18柱（250mm×4．6mm，5μm）；流动相为甲醇－0．5%磷酸水溶液（47：53）；柱温：25℃；流速：0．7ml／min；检测波长：356nm；理论塔板数按芦丁和槲皮素计算均大于4000。外标法定量分析。对照品和样品色谱图见图1。

图1 对照品及枸骨样品高效液相色谱图

2．2 对照品溶液的制备

用甲醇分别溶解干燥至恒重的芦丁和槲皮素对照品适量，配制成芦丁0．26mg／ml和槲皮素0．17mg／ml的混合对照品溶液。

2．3 线性关系考察

参照文献［6－7］进行线性关系考察，得芦丁和槲皮素的回归方程分别为Y＝15587X＋20055（r＝0．9999），Y＝40012X－48581（r＝0．9999），芦丁和槲皮素的线性范围分别为0．52～5．2μg和0．34～3．4μg。

2．4 样品溶液的制备

分别精密称取5．0g枸骨嫩叶、老叶、枝、青果、红果及不同采收期枸骨叶粉末（过40目筛），加适量90%乙醇超声提取2次，每次30min，合并2次滤液浓缩得浸膏，用甲醇定容至25ml容量瓶中，摇匀，用微孔滤膜（0．45μm）滤过，取续滤液为样品溶液。

2．5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液20μL，连续进样6次，结果芦丁和槲皮素的峰面积RSD分别为0．78%和0．91%。

2．6 稳定性试验

参照文献［8］进行稳定性试验，结果表明供试品溶液在10h内稳定性良好，峰面积的RSD为0．81% （n＝6）。

2．7 重复性试验

精密称取枸骨老叶样品6份（每份5．0g），按样品溶液制备方法制备6份样品溶液，各进样20μL测定。结果RSD为1．73%，表明方法重复性良好。

2．8 加样回收率试验

参照文献［9］进行回收率试验，计算芦丁和槲皮素平均回收率（n＝6）分别为98．6%和99．2%，RSD分别为1．70%和1．91%。

2．9 样品测定

按样品溶液制备方法制备各样品溶液，按上述色谱条件进样20μL，得各样品芦丁和槲皮素含量，结果见表1和表2。

表2 不同采收期枸骨叶中芦丁和槲皮素含量测定结果（n＝3）

3 讨论

3．1 提取条件的选择

本实验考察了加热回流和超声提取2种方法，结果表明超声提取率高，杂质少，故选取超声提取法；提取溶剂的选择我们比较了甲醇和不同浓度乙醇的提取效率，结果表明用90%乙醇提取效果最好；同时比较了超声提取时间及提取次数的提取率，结果表明超声提取2次，每次30min提取率最高，根据实验结果最终确定样品提取方法为采用90%乙醇为提取溶剂，超声提取2次，每次30 min。

3．2 测定波长的选择

对混合对照品和样品溶液在200～600nm进行紫外扫描，结果表明，两者均在356nm波长处有最大吸收，且干扰比较小，故选择356nm作为检测波长。

3．3 流动相的选择

本实验对甲醇－冰醋酸水溶液系统、甲醇－水系统、甲醇－0．5%磷酸水溶液系统进行了考察，结果显示，甲醇－0．5%磷酸水溶液系统（47∶53）分离度好、峰形较好，满足分离要求。

3．4 小结

本文采用反相高效液相色谱法测定了枸骨不同部位：嫩叶、老叶、枝、青果、红果及不同采收期枸骨叶中芦丁和槲皮素含量，测定结果表明，枸骨中芦丁和槲皮素含量与药用部位有关，叶中的含量明显高于其他部位，与传统入药部位为叶相吻合，不同部位的芦丁和槲皮素含量顺序均为：叶＞枝＞果实，且同一部位中芦丁含量均高于槲皮素；不同采收期枸骨叶中黄酮类化合物含量有显著差异，其中3月份含量最高。另外，2010年版中国药典一部收录的枸骨叶，质量标准没有含量测定项，本文为枸骨叶质量标准的完善提供了科学依据。

［1］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典一部［S］．北京：中国医药科技出版社，2010：233．

［2］ 邱丰艳，王小精．冬青属苦丁茶的药理研究进展［J］．安徽农业科学，2007，35（32）：10350－10352．

［3］ 李维林，吴菊兰，任冰如，等．枸骨的化学成分［J］．植物资源与环境学报，2003，12（2）：1－5．

［4］ 左文健，梅文莉，曾艳波，等．枸骨的化学成分和药理活性研究进展［J］．安徽农业科学，2011，39（27）：16560－16562．

［5］ 洪艳平，上官新晨，刘楠，等．枸骨叶总黄酮提取与测定［J］．江西农业大学学报，2008，30（3）：529－533．

［6］ 崔涛，夏伟军，彭玲芳．七叶莲提取物中总黄酮和槲皮素的含量测定［J］．药物分析杂志，2011，31（11）：2054－2057．

［7］ 茅向军，许乾丽，鲍家科，等．HPLC法测定一枝黄花中芦丁的含量［J］．药物分析杂志，2010，30（9）：1785－1787．

［8］ 徐力．HPLC法测定飞燕草中芦丁的含量［J］．中国当代医药，2011，18（33）：49－50．

［9］ 王金梅，高健，郅妙利，等．HPLC法测定连翘中叶、茎、果实等不同部位芦丁的含量［J］．河南大学学报，2007，26（4）：23－25．