发酵生产燃料乙醇过程中野生酵母的污染和控制

刘 辉，宫殿良

（中粮生化能源（肇东）有限公司， 黑龙江 肇东 151100）

发酵生产燃料乙醇过程中野生酵母的污染和控制

刘 辉，宫殿良

（中粮生化能源（肇东）有限公司， 黑龙江 肇东 151100）

综述了燃料乙醇发酵过程中野生酵母的污染来源、检测方法以及预防和控制。利用这些信息，可以在实际生产中有效控制野生酵母，以提高工厂燃料乙醇的收率。

野生酵母；燃料乙醇；发酵；控制

野生酵母是指在发酵过程中不能完全控制或是不需要的一类酵母[1]。野生酵母可能是来自很多方面，例如被污染的培养基、杂质含量高的谷物、生产中的循环系统、活性干酵母或是酵母乳等初始来源的酵母、种子罐、未除菌的空气和不卫生的设备和场地等[2]。另外，同其他的污染微生物一样，这些野生酵母很可能由昆虫所传播，这些昆虫破坏了原料或是在工厂内传播[3]。这些野生酵母的污染可以引起酒精产量或是生产率的下降。有时候由于野生酵母的污染，乙醇产量甚至可以降低百分之一，这将会对原本利润不高的燃料乙醇工厂造成不利影响。因此，对野生酵母有一个详尽的了解、检测及抵御措施变得尤为重要。本文从对野生酵母的介绍、检测方法、预防与控制三个方面进行综述。

1 野生酵母

野生酿酒酵母的定义很难去描述。然而，假设我们按照以上提出的概念，那么不能用来发酵的酵母都可以称之为野生酵母。严格来讲，A车间的酵母可被定义为B车间的野生酵母。很大程度上，野生酵母相对于生产酵母具有可改变的生化和生理特性。很多酿酒酵母可以产硫化氢和较高水平的乙酸，这说明在酿酒酵母属中存在很大程度的代谢多样性。事实上，有的酿酒酵母会产生有毒因子来杀死其他酵母，例如众所周知的zymocins毒素。实验室的酵母及从自然分离出的酵母也大多对其他酵母有一定的毒害作用。在发酵生产中，乙醇产量降低、生产率下降或是酵母生长不好等都可能源自野生酵母污染。但有时，上述出现的这些情况也不会那么明显[4]。如果是连续发酵或是酵母反复使用，这种微小的变化可能被放大。有时这种由野生酵母引起的微小变化很难被检测到，成为潜在的危害。

除了酿酒型野生酵母以外，很多菌株包括酒香酵母，假丝酵母，隐球酵母，德巴利酵母属，德克酵母，内真菌属酵母，网孢菌属酵母，克鲁维属酵母，裂殖酵母属，球拟酵母等，经常在酒精发酵企业中被发现[5]。例如，很多文献报道了德克酵母在白酒行业中被看做是最具有破坏性的野生酵母。而且，德克酵母在啤酒行业甚至是软饮料行业也被看做是典型的野生污染酵母。这些酵母可以生产大量的乙酸来抑制常规酵母。目前，在燃料乙醇生产过程中，德克酵母已经得到各厂家的重视，尤其是在连续发酵生产工艺中备受关注。随着野生酵母数的增长，导致乙酸的大量生成、乙醇产量降低、发酵缓慢甚至发酵提前终止。经检测分析，在发酵成熟醪中并未检出乙酸菌，而是含有许多异常的酵母细胞，可见，野生酵母是引起上述发酵异常的重要因素之一[6]。

在生产中，这些野生酵母代谢了本可以被生产酵母利用的糖，并生成了不利于生产酵母的物质，从而使得酒精产量降低，生产率下降。覆盖粘贴在这里正文内容覆盖粘贴在这里。

2 野生酵母的检测

由于野生酵母特别是野生酿酒酵母的形态、生理和生化方面与常规酵母非常相似，所以很难进行检测。然而，随着科技的进步一系列的检测技术被开发和使用来检测野生酵母。经典的鉴定方法包括电镜、显微镜，形态学等等通常是适用的。但这些方法的主要问题是酵母需要在固体培养基中培养，这就造成检测时间过长，不能及时的检测出污染位置并且找到补救措施。因此，快速的分子方法就变得越来越流行。首先，最重要的任务是找到常规酵母全面的表征特性，用于区分其他的野生酵母。为了获得大量的信息，就必须要做基因鉴定，通常是鉴定到种。精密的分析一般都是基于基因分析，这就使分析更加复杂并且需要使用特殊的工具和特殊训练。

目前来看，没有一个简单的方法或材料可以同时检测到常规酵母和所有的野生酵母。相差显微镜很可能是从常规酵母中分辨出野生酵母最简单的技术。酿酒酵母是典型的圆形或椭圆形，而许多野生酵母是细长的或是奇怪的形状，往往还有成串的趋势。传统的方法，可以用醋酸钾或醋酸铵来试验产孢子能力从而检测野生酵母[7]。在显微镜实验中，可以区分产芽孢的野生酵母和正常生产酵母，因为正常酵母已经失去了它们的产孢能力。其他类型的显微镜如免疫荧光染色显微镜，也常常用于检测野生酵母，但是这些技术灵敏性和专一性不是很好[8]。大部分检测野生酵母的方法是使用不同的选择培养基，因为污染的酵母通常数量较少，需要进行扩培才能准确的估计出其数量。在过去的几十年里，研究人员开发出大量的固体培养基用来检测野生酵母菌。这些培养基有选择性的被设计成有助于或是抑制一种特定的酵母。从根本上讲，所有的选择培养基都会添加一种抑制组分如硫酸铜，结晶紫等，或是添加一种常规酵母无法使用的物质如赖氨酸、硝酸盐、木糖和糊精等。例如放线菌酮，是一种酵母选择性抑制剂，可以阻碍蛋白合成的启动和延长，从而抑制酿酒酵母的生长。但是很多非酿酒酵母例如德克酵母、克勒克酵母和粟酒酵母对放线菌酮有耐受性。因此，放线菌酮提供了一个非常好的筛选工具来检测非酿酒酵母[9]。

品红亚硫酸可以用来抑制正常酵母，而不抑制野生酵母。但是，在这种情况下，需要对抑制剂的加量进行优化，因为如果加量较低，常规酵母也可以进行生长。这些化学品的批次不同抑制情况也有差别。所以，常规酵母需要经常在每一种培养基中试验，通过判断哪种组分在培养基需要添加。类似的培养基还有结晶紫SDM培养基等等。

其他的选择培养基不依赖于上述生长抑制剂，而是使用一种特定的底物仅可以供特定酵母生长。赖氨酸培养基、CLEN培养基和XMACS培养基都是利用这种原则培养基的例子。常规酵母无法利用赖氨酸作为唯一的氮源，这种培养基可以用来筛选非酿酒野生酵母[10]。

除了上述培养基和其他选择培养基外，还有许多不同的培养基用来检测野生酵母。例如，包含pH敏感的溴甲酚绿用来检测产酸酵母，因为很多酵母都可以产酸。基础培养基添加0.5%w/v的CaCO3对于分离产酸酵母很有效果，因为产酸酵母在这种培养基中会在菌落周围产生明显的圈[11]。

20世纪80年代，分子生物学和遗传学鉴定技术逐渐发展起来，鉴定酵母菌的方法主要有：G+C%测定、辅酶Q系的测试、酵母胞壁甘露聚糖核磁共振氢谱(PRA)测试、确定单倍体细胞中DNA含量、以及DNA-RNA和DNA-DNA杂交重组的研究。这些新技术不仅为野生酵母鉴定提供了快速简便的方法，而且更加精准[12]。

3 野生酵母的预防与控制

野生酵母污染的一个重要来源是在常规酵母生产过程中的干燥，压缩或是混合的时候出现的。由于在生产过程中大多数酵母是连续培养，所以在工厂发酵初始培养时低水平的杂菌（细菌和真菌）污染无处不在。然而污染程度在工段之间，甚至是批次之间都是有变化的。因此有必要定期监测这些培养液中的杂菌，甚至是稀释的酵母接种醪液里也需要监测。如果不经过正确处理，储存或是杀菌，未过滤的空气，水，甚至是酶制剂也都可能是野生酵母的来源。玉米和其他原料间也是野生酵母的一个重要来源。那些不光滑的表面，包括阀门、垫片管道死角以及CIP系统的隐蔽处都有可能出问题，因为它们很难被彻底消毒。工厂内部卫生条件不好，野生酵母可能通过昆虫进行传播，从而在糖中，水中或是玉米颗粒中生存[13]。尽管使用热碱液对管道、罐以及输送泵进行消毒，或是在发酵过程中使用抗生素或其他杀菌剂，但是也需要额外细致的工作来保证环境卫生。换热器中用来换热的水也是野生酵母的重要来源。最后，在没有适当的措施下，酵母回收利用或是其他过程（清液回配）也容易引起野生酵母污染。相对于酵母的回收利用，用酸洗可以有效的限制细菌但是对于很多野生酵母限制效果有限。最保险的办法就是使用活化罐对质量好的酵母进行重新培养。尽管可能会有一些由微生物代谢的抑制化合物随着清液回到前段工序但对于清液回配或是其他回配的水来说，它们应该重新再回到前段拌料工序来避免污染。从根本上说，好的卫生条件，适当的储存和处理可以阻止野生酵母的污染[14]。此外，对生产过程的物料进行日常微生物检测，来确定“问题点”也可以预防污染的爆发。

有时候，尽管所有预防措施都使用了，野生酵母的污染还是会发生的。延长发酵时间或是循环使用酵母等都是比较敏感的问题。野生酵母的选择性消除是比较困难的，因为大多数能杀死野生酵母的方法也能杀死正常生产酵母。例如，二氧化硫、二甲基二碳酸盐和山梨酸用在白酒工业中，用来防止酵母的生长，这些对野生酵母和常规酵母都有抑制。同样，用于控制野生酵母的过滤法、热灭活法、杀菌剂、毒素法对所有酵母都是有害的[15]。所以，唯一的方法就是将发酵罐或是整个生产工段停下来进行彻底的清洗和消毒。即使这样，经过几个周期下来野生酵母又开始重新生长。所以，有必要再所有设备中执行严格的清洁和消毒标准，保证野生酵母在全段工序被阻止。

4 结论与展望

尽管对于野生酵母的防范和控制措施的报道较少，但是通过对野生酵母的认识，以及掌握了野生酵母的来源，并采用一系列的预防及控制方法，可以将污染程度控制到最低，从而来降低燃料乙醇生产中由野生酵母污染引起的经济损失。目前有很多的研究者正在研究这一方面的问题，相信未来会有更多的研究成果提供参考，发挥重大作用。

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［3］Stratford M,Bond CJ,et al. A potential soft-drinks spoilage yeast isolated from a wasp[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.,2002,52:1369-1375.

［4］Briggs DE, boulton CA, et al.Brewing Science and Practise[M].Woodhead Publishing,2004.

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［14］Allen F. Wild yeast detection and remediation[J].Brewing Techniques.,1994,2:36-41.

［15］Couto JA, Neves F,et al. Thermal inactivation of the wine spoilage yeasts Dekkera/Brettanomyces[J].International Journal of Food Microbiology.,2005,04:337-344.．

Contamination and Control of Wild Yeast in the Production Process of Fuel Ethanol by Fermentation

LIU Hui，GONG Dian-liang
（COFCO Bio-energy(Zhaodong)Co., Ltd., Heilongjiang Zhaodong 151100，China）

The sources, detection methods, prevention and control of wild yeast in the production process of fuel ethanol by fermentation were reviewed. Using this information, we can effectively control the growth of the wild yeast in the actual production to improve the yield of ethanol.

wild yeast; fuel ethanol; fermentation; control

TQ 214

A

1671-0460（2015）08-2051-03

2015-07-08

刘辉（1972-），女，黑龙江肇东人，高级工程师，硕士，研究方向：主要从事谷物发酵生产酒精方面的研究工作。E-mail：liuhui06081997@163.com。