丁酸和植物提取物在动物组蛋白乙酰化中的作用

马 涛 刁其玉

(中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点实验室，北京 100081)

表观遗传学一直是遗传学研究的热点，指在基因组序列不发生改变的情况下，基因的表达发生可遗传的变异，是环境因素和细胞内的遗传物质相互作用的结果，主要包括组蛋白乙酰化、磷酸化、泛素化，DNA甲基化以及 microRNA调控等［1-2］。尽管目前已经确定营养素具有调控表观遗传的作用，但对于营养素调控表观遗传内在机制的研究相对较少，就畜禽而言，相关研究更是处在起步阶段。

组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白质，是一类小分子碱性蛋白质。决定组蛋白乙酰化状态的酶有2类:组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)。HAT的作用是对组蛋白N端进行乙酰化修饰，使核小体结构松散、激活基因转录;HDAC则对其N端进行去乙酰化修饰，抑制基因转录［3］。目前在哺乳动物中已发现的HDAC根据其与酵母的同源性可分为3种类型:Ⅰ型包括 HDAC1、HDAC2、HDAC3 和 HDAC8，分子质量在42～45 ku，该类型全部位于细胞核内，调控组蛋白乙酰化修饰;Ⅱ型包括HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9 和 HDAC10，分子质量为120～130 ku，主要位于细胞质，但可在细胞质与细胞核间穿梭，调控组蛋白及非组蛋白的乙酰化修饰;Ⅲ型则与细胞衰老和能量代谢的调节相关［4］。HAT和HDAC作用的平衡一旦被打破，即出现乙酰化失衡，将导致肿瘤的发生。研究表明丁酸和部分植物提取物(如姜黄素、萝卜硫素等)都能够使组蛋白高度乙酰化，具有HDAC抑制剂的作用［5］。

1 丁酸对组蛋白乙酰化的影响

挥发性脂肪酸(VFA)或短链脂肪酸(SCFA)是目前具有代表性的“营养素—表观遗传—表现型”实例，SCFA为哺乳动物胃肠道微生物发酵饲粮中碳水化合物后的产物，能够为反刍动物提供高达70%的能量需要［6］，其中乙酸和丙酸浓度往往较高，也是主要的能量来源，而丁酸浓度较低。研究表明丁酸除了作为一种能量来源外，还起到调节细胞分化、增殖、死亡以及诱导细胞周期停滞和凋亡的作用［7-9］。以丁酸为例，其能够使细胞组蛋白高度乙酰化。

为研究细胞生长是否受丁酸的抑制，Li等［10］使用2.5～10.0 mmol/L浓度的丁酸钠处理牛肾(Madin Darby bovine kidney，MDBK)细胞系，发现丁酸钠不仅导致细胞凋零，而且使细胞周期停滞在G1/S和M/G2的分界处，且随丁酸浓度的升高，细胞凋零数量呈正相关升高(R2=0.948 2)。牛肾细胞在经丁酸钠处理后，积累大量乙酰化的组蛋白，同时半胱天冬酶得到激活，半胱天冬酶是细胞凋亡过程中的关键酶，由此揭示了丁酸导致细胞凋亡和细胞周期停滞可能的机制，即丁酸作为HDAC抑制剂，能够激活细胞中由于不适当的组蛋白去乙酰化而表达受阻的基因(如肿瘤抑制基因)，该基因能够终止非正常细胞的周期，促使其凋亡，防止发生恶变。与此相近，Das等［11］研究发现培养基中添加1.0或5.0 mmol/L的丁酸钠，能够显著提高猪成纤维细胞组蛋白乙酰化程度。

在体外细胞试验开展的同时，也有部分研究者通过动物试验来研究丁酸对于机体组织组蛋白乙酰化的影响。Leu等［12］通过给大鼠饲喂5种不同形式的含高抗性淀粉(占饲粮总淀粉含量的46% ～53%)的饲粮，并通过注射氧化偶氮甲烷诱导结肠细胞DNA损伤，研究饲粮处理对大鼠结肠发酵及对DNA受损细胞的影响。结果表明，其中3种形式的淀粉饲粮能够显著提高大鼠结肠中丁酸浓度，并且增强对于DNA受损细胞的凋亡应答，证明丁酸在动物体内同样能够起到诱导非正常细胞凋亡，防止细胞癌变的作用。

细胞周期受3类蛋白质家族的调控，包括细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂［13］。研究表明丁酸能够下调人类小肠细胞周期蛋白D1的mRNA，以及成纤维细胞中细胞周期蛋白D1的表达［14］，因此 Kien等［15］通过分别给仔猪饲喂乳果糖和向其盲肠内灌注丁酸测定盲肠组织组蛋白乙酰化程度、细胞周期蛋白D1表达量以及细胞增殖情况，来研究体内试验结果是否与体外试验相符，结果表明，饲喂乳果糖的仔猪盲肠内丁酸浓度显著升高，导致组蛋白乙酰化程度升高;然而盲肠内灌注丁酸显著降低了组蛋白乙酰化程度。2个试验中均能够得出组蛋白乙酰化程度与仔猪盲肠细胞周期蛋白D1表达量呈正相关的结论，与公认的组蛋白乙酰化能够易化基因表达的研究结果［14］相符。当饲喂仔猪乳果糖产生“内源”丁酸时，与体外细胞试验结果相同，即丁酸的HDAC抑制剂作用得到体现，乙酰化程度和细胞周期蛋白D1表达量均高于对照组;但当灌注“外源”丁酸时，则出现与体外相反的结果，乙酰化程度和细胞周期蛋白D1表达量均低于对照组。研究者将这一结果首先归结于丁酸对于体外培养细胞的影响并不能反映体内的生理情况，因为先前结果表明，盲肠肠腔内的丁酸浓度不随丁酸进入盲肠的速率以及丁酸在盲肠内的吸收速率的变化而变化［16］，因此肠腔内的丁酸浓度并不能反映供给肠细胞的丁酸浓度;其次饲喂乳果糖会造成盲肠中梭菌密度下降至原有的约1/16，微生物群落的变化也可能会通过调节免疫应答来影响细胞增殖及组蛋白乙酰化程度。

此外，Mátis等［17］研究了口服丁酸药丸对鸡肝脏组蛋白乙酰化和细胞色素相关酶活性的影响，亦旨在验证体内试验结果是否能够反映体外试验结果。分别给1日龄肉仔鸡口腔灌注2种浓度［0.25或 1.25 g/(kg BW·d)］的丁酸药丸连续5 d，随后屠宰取肝脏细胞核及微粒体等组织，分别测定细胞核组蛋白乙酰化程度以及微粒体中细胞色素相关酶活性。试验结果表明，虽然灌注丁酸能够使肝脏组织细胞核组蛋白高度乙酰化，但细胞色素相关酶活性未发生变化，可见在实际生理条件下，丁酸并未体现出作为HDAC抑制剂在体外能够影响细胞色素相关酶活性的作用［18］，这可能与饲粮营养水平、饲料原料和环境等多方面因素有关。由此可见，丁酸对于动物体内组蛋白乙酰化的影响远比体外对细胞的研究复杂的多，很多体外研究结果尚须体内试验进行验证。

2 植物提取物对组蛋白乙酰化的影响

2.1 姜黄素(curcumin)

姜黄素是植物姜黄的主要成分，是印度和东南亚常用的一种香料，同时也具有抗炎症和抗氧化的功能［19］，研究表明姜黄素能够抑制HDAC1、HDAC3、以及 p300/CBP(属于 HAT蛋白家族)，从而抑制细胞增殖［20］;Liu等［21］同样证实姜黄素能够抑制淋巴瘤胃细胞中Ⅰ型HDAC的表达;在以小鼠为试验动物的研究中，姜黄素能够降低肿瘤的生长，提高成神经管细胞瘤小鼠的成活率，其潜在机制为降低了HDAC4的表达，提高微管蛋白乙酰化程度，调节基因表达，从而促使肿瘤细胞凋亡［19］。

2.2 萝卜硫素(sulforaphane)

萝卜硫素是一类存在于花菜、甘蓝、卷心菜中的植物化学素，能够促进异型生物质代谢，从而诱导细胞周期停滞及凋亡［22］。目前开展的动物试验相对有限，Myzak等［23］给小鼠口服 10 μmol的萝卜硫素，发现6 h后其结肠黏膜HDAC活性显著降低，免疫印迹结果同时表明组蛋白H3和H4的乙酰化程度显著升高，直到48 h恢复到正常水平;而长期饲喂添加萝卜硫素的饲粮的小鼠盲肠、结肠、前列腺、外周血液单核细胞的组蛋白乙酰化水平均上升。该研究小组另一研究结果表明，当小鼠每天采食7.5μmol萝卜硫素，前列腺和单核血细胞中HDAC活性相比对照组显著降低［24］，从而证实了萝卜硫素在小鼠体内具有抑制HDAC活性的作用。

2.3 有机硫化合物

葱属植物包括大蒜、韭菜等主要的功能性成分为有机硫化合物，包括二烯丙基一硫醚(diallyl sulfide，DAS)、二烯丙基二硫醚(diallyl disulfide，DADS)、二烯丙基三硫醚(diallyl trisulfide，DATS)。有机硫化合物已被广泛证实具有抗癌作用，其机制为能够介导细胞周期停滞和凋亡、抑制癌细胞生长等［25］。体内试验结果表明，DADS能够有效抑制异种转移模型小鼠器官癌变以及肿瘤生长，DADS及其代谢物S-烯丙半胱氨酸最终转化成烯丙硫醇，DAS、DADS和DATS均为有效的HDAC 抑制剂［26］。

2.4 槲皮素(quercetin)

多酚具有广泛的抗微生物和抗炎症作用，槲皮素是一类主要存在于柑桔类和荞麦中的生物黄酮。细胞试验结果表明，槲皮素能够通过促进组蛋白乙酰化从而达到抗肿瘤、诱导细胞凋亡的作用［27-28］。动物试验研究表明槲皮素能够缓解降低经致癌物二甲基苯蒽处理仓鼠的肿瘤发生率、并显著降低肿瘤生长速度，该作用与槲皮素抑制HDAC1的作用呈显著正相关［29］。

其他植物提取物包括茶多酚［30-31］、二吲哚甲烷［32］、大豆异黄酮［33］、异硫氰酸苯酯［34-35］、白藜芦醇［36］等均具有HDAC抑制剂的作用，但上述提取物作为饲料添加剂成分对于动物表观遗传的影响研究相对较少，甚至以小鼠或仔猪为模型动物的研究报道也不多见，因此还有很大的研究空间。

3 潜在的HDAC抑制剂——维生素E

丁酸是已知的最小分子质量的HDAC抑制剂，其分子由丙基和羧基组成，其中的丙基能够和HDAC的活性基团相匹配［37］，从而起到抑制HDAC的作用。生物素、α-硫锌酸以及维生素E的代谢产物在结构上均具备类似于丁酸“丙基”的能够与HDAC活性基团相互作用的基团［38］，因此上述饲粮营养素可能也具有潜在的HDAC抑制剂的作用。

维生素E是一种常见的营养添加剂，以8种不同的形式(α-、β-、γ-、δ-生育酚/生育三烯酚)存在于植物当中，其中α-生育酚是自然界中分布最广泛、含量最丰富、活性最高的维生素E形式，且其是人类和动物体内沉积的维生素E的主要形式［39］。研究表明，α-琥珀酸生育酚相对其他形式的维生素E能够更有效地介导鼠细胞分化、抑制细胞增殖、促使细胞凋亡［40］。维生素 E作为一种营养添加剂，能够提高畜禽生产性能，但其机理一直未完全搞清楚。

近年来研究发现α-生育酚除具有脂溶性抗氧化剂的作用外，还能够调节信号传导及基因表达［41-42］。Li等［43］使用 α - 生育酚处理正常培养基条件下MDBK细胞，通过流式细胞仪分析发现，α-生育酚能够介导细胞周期停滞在G1/S分界处，且细胞生长受抑制程度与α-生育酚剂量呈正相关，表明α-生育酚具有抑制细胞增殖的作用。为进一步研究α-生育酚介导细胞周期停滞的潜在机制，采用高密度寡核苷酸微阵列分析α-生育酚调控后的MDBK细胞全局基因表达情况，结果显示有2.60%(1 183/45 383)的基因受α-生育酚的影响，其中包含与细胞周期、核酸代谢、DNA复制相关的基因。虽然目前尚未明确α-生育酚调控基因表达及其潜在的抑制HDAC的机制，但细胞层面的研究为今后理解维生素E影响畜禽生产性能的机理提供了帮助。

4 小结

越来越多的饲料添加剂被证实具有HDAC抑制剂或其他影响表观遗传的功能，表明传统意义上可作为饲粮成分的物质能够通过调节表观遗传机制来改变动物的表型特征。然而目前相关研究大多限于人类和小鼠上，对于实际生产中畜禽的影响研究还比较匮乏，随着生物技术的快速发展，能够帮助我们深入理解饲料添加剂调控畜禽表观遗传的机制，对于促进畜禽产业发展具有积极影响。

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