大麦虫蛋白质酶解产物对小鼠学习记忆能力和抗疲劳能力的影响

王南溪,杨 伟,杨春平,杨 桦,杨学圳,沈雨曦

(四川农业大学林学院,森林保护省级重点实验室,四川雅安 625014)



大麦虫蛋白质酶解产物对小鼠学习记忆能力和抗疲劳能力的影响

王南溪,杨 伟*,杨春平,杨 桦,杨学圳,沈雨曦

(四川农业大学林学院,森林保护省级重点实验室,四川雅安 625014)

为探讨大麦虫蛋白质酶解产物对KM小鼠学习记忆能力和抗疲劳能力的影响,本文采用Morris水迷宫法、爬竿实验和负重游泳实验分别测试灌胃了不同剂量该酶解产物30d后小鼠学习记忆与抗疲劳的情况。结果显示,Morris水迷宫实验中,未灌胃大麦虫蛋白质酶解产物的对照组潜伏期比低、中、高剂量组长17.2%～62.8%,反应次数少19.7%～164.3%,且中剂量组的潜伏期和反应次数与对照组差异均极显著(p<0.01)。爬竿实验和负重游泳实验中,未灌胃该酶解产物的对照组负重游泳成绩比其他三组低1.9%～16.4%;爬竿成绩低6.2%～29.8%,其中,中剂量组的这两项实验成绩均极显著高于低、高剂量组(p<0.01)。表明大麦虫蛋白质酶解产物具有提高小鼠学习记忆能力和抗疲劳能力的功效,且影响程度与其剂量有关,中剂量(1.67g/(kg·d))为较适剂量。

大麦虫蛋白质酶解产物,KM小鼠,学习记忆能力,抗疲劳能力

蛋白质的摄入量反映了一个国家的营养水平[1],已有研究表明,我国人均蛋白质摄入量低于世界平均水平[2],其摄入量的不足会给人体健康带来隐患。如何解决蛋白质资源短缺的问题,并提高我国居民膳食水平,已经到了迫在眉睫的程度。因此,越来越多的人将目光投向新型蛋白源昆虫—大麦虫(ZophobsmorioL.),其不仅繁殖速度快,具有一定的人工养殖规模[3],且较其他资源昆虫而言蛋白质含量丰富,鲜虫体的粗蛋白含量为22.3%[4-6];氨基酸组成合理,必需与非必需氨基酸的比值达0.79～0.88[7],超过了FA/WHO标准的推荐值[8]。大麦虫蛋白质具有健脑益智、调节免疫力、增强抗疲劳力等功效,其经酶解后生成的氨基酸和多肽更易被动物体吸收[9]。但是,目前对大麦虫的研究还停留在饲料及饲料添加剂的开发利用层面上[10-11],对其在食品及食品添加剂、昆虫蛋白生物活性功能方面的研究尚少[12-14]。本文以大麦虫幼虫为蛋白质原料,用碱性蛋白酶酶解脱脂虫粉获得的酶解产物灌胃处理KM小鼠,并采用Morris水迷宫法、爬竿实验和负重游泳实验分别测试灌胃不同剂量酶解产物的小鼠的学习记忆与抗疲劳效果,并分析该酶解产物对小鼠学习记忆能力与抗疲劳能力的影响,为进一步开发和利用大麦虫提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

KM小鼠 雌雄各40只体重在(20±2)g的断乳小鼠；4kg大麦虫幼虫 均由四川农业大学森林保护实验室提供;乙醚 西陇化工股份有限公司,分析纯;碱性蛋白酶 潍坊奥迪尔进出口贸易有限公司;氢氧化钠 中国成都高欣化学试剂厂,分析纯;盐酸 西陇化工股份有限公司,分析纯。

DHG-9104电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;LD-Y300A型粉碎机 上海顶帅电器有限公司;SZF-06A型脂肪仪 上海精隆科学仪器有限公司;飞鸽牌TDL-5-A型离心机 上海安亭科学仪器厂;JA2003A型电子天平 上海精天电子仪器有限公司;Morris水迷宫 上海欣软信息科技有限公司;EthoVision3.0行为分析仪 荷兰诺达斯信息技术有限责任公司;DELTA320型pH计 上海摩速科学器材有限公司;DK-S26恒温水浴锅 上海申生科技有限公司;S212恒速电动搅拌器 上海凌科实业发展有限公司;WI64537爬杆实验装置 上海欣软信息科技有限公司。

1.2 样品的制备与特性

将4kg大麦虫幼虫洗净放入80℃的烘箱中干燥至恒重,用粉碎机将其打磨成粉,并用定性滤纸包裹。将包好的虫粉放入装有150mL无水乙醚的索氏提取器,并置于55℃的恒温水浴锅中。控制乙醚回流次数为(10±2)次/h,试样抽提8h后取出。将得到的脱脂虫粉烘干后加水配成浓度为6.7%±0.2%的溶液并煮沸灭菌10min,然后置于恒温搅拌器中加热至(59.5±0.5)℃。称取适量碱性蛋白酶于(59.5±0.5)℃的恒温水浴锅中加热10min,用NaOH溶液调pH至9.3±0.1后迅速加入备好的脱脂溶液酶解(3.2±0.4)h,酶底质量比为3.7%±0.2%,酶解过程中不断加入HCl溶液和NaOH溶液以维持pH恒定。酶解结束,沸水浴10min灭酶,冷却至室温,经10000r/min离心10min,取上清液冷藏备用,得到的大麦虫蛋白质酶解产物的多肽含量为38.847mg/mL[15-18]。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组及给药 实验小鼠的分组及饲养:KM小鼠雌雄各20只随机分成4组,即智力组大麦虫蛋白质酶解产物的低、中、高剂量组(A1、A2、A3),对照组(A4),每组雌雄小鼠各5只;另选雌雄各20只小鼠按照相同的方法处理,即体力组,用B表示。整个实验期间,各组小鼠自由取食和饮用相同的饲料和酸化水,室内温度保持在(22±2)℃。

大麦虫蛋白质酶解产物剂量设定与灌胃:根据戚颖欣等人[19]报道的蚕蛹蛋白肽的人体推荐用量来计算出样品的适用量为0.167g/(kg·d)。将低、中、高剂量设计为适用量的5倍、10倍、25倍,分别为0.83、1.67、4.17g/(kg·d),对照组为阴性对照。连续30d,每天定时给各组小鼠灌胃相应剂量的样品,每2d称重一次并调整灌胃剂量。最后一次灌胃的次日开始对A、B组小鼠分别进行水迷宫实验和爬杆、负重游泳实验。

1.3.2 小鼠Morris水迷宫实验 将灌胃结束后的A组小鼠放入水迷宫(Φ=90 cm)中进行记忆训练,实验水温(25±2)℃。每只小鼠每天训练其搜寻平台4次,每次2min,如果2min未搜寻到平台,教其爬上平台。对小鼠进行4d的水迷宫训练后第5d撤掉平台测试其学习能力,每只小鼠测试1次。休息4d后,在第10d依照第5d的方法再次测试小鼠的记忆能力[20]。学习与搜寻行为均由EthoVision3.0行为分析仪进行记录与分析。

1.3.3 小鼠爬杆、负重游泳实验 小鼠爬杆实验:末次灌胃后24h将B组小鼠放在置于水温(15±0.5)℃、深10cm的水盆上方的有机玻璃杆上端并让其自主抓住爬杆,使其肌肉处于静力紧张状态。记录小鼠从抓住爬杆到因肌肉疲劳无力从爬杆上滑落的时间,每只小鼠测试3次,累计3次时间为小鼠的爬杆成绩。

小鼠负重游泳实验:爬竿实验结束后,再次灌胃B组小鼠,24h后称量小鼠体重并做好记录。给每只小鼠的尾根部负荷其自身体重5%的铅皮,然后将小鼠放入水温为(25±1)℃的游泳箱,开始测试。记录小鼠自开始游泳至溺水死亡的时间,作为其负重游泳成绩。

1.4 数据处理

采用EthoVision3.0行为分析软件处理Morris水迷宫实验的数据,经行为仪处理后所得的水迷宫实验结果和爬杆实验结果、负重游泳实验结果均采用SPSS15.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 大麦虫蛋白质酶解产物对小鼠体重增长的影响

本实验测定小鼠在灌胃大麦虫蛋白质酶解产物前及30d后的体重变化,并分别对智力组和体力组中不同剂量处理的小鼠的体重进行多重比较,见表1。经分析,灌胃前智力组和体力组中各处理的体重差异均不显著(p>0.05)。灌胃该酶解产物30d后,智力组与体力组中对照组小鼠的体重均极显著低于低、中、高剂量组(p<0.01);而高剂量组与低剂量组差异极显著(p<0.01),与中剂量组无显著差异(p>0.05),且两组内各处理的小鼠平均增重量呈现出从高、中、低剂量组到对照组依次降低的规律。

表1 大麦虫蛋白质酶解产物对小鼠体重的影响(n=10)Table 1 Effects of Zophobs morio protein hydrolysates on weight of mice(n=10)

注:W0:灌胃前KM小鼠的体重;WT:灌胃30d后KM小鼠的体重。将表中数据进行同列比较,大写字母不同表示差异极显著(p<0.01);小写字母不同表示差异显著(p<0.05)。下同。

表2 小鼠Morris水迷宫实验训练成绩(n=10)Table 2 Training results of mice in Morris water maze test(n=10)

表3 小鼠Morris水迷宫实验记忆及遗忘测试成绩(n=10,Mean±S.E)Table 3 Test results of memory and forgetting of mice in Morris water maze test(n=10,Mean±S.E)

根据肽营养理论,蛋白质以小肽的形式被吸收可以消除游离氨基酸在吸收过程中的电荷竞争,促进氨基酸和一些矿质元素的吸收[21]。在本实验中,大麦虫蛋白质酶解产物中的小肽促进了小鼠对氨基酸和矿质元素的吸收,有利于其的生长发育,因此,灌胃了该酶解产物的小鼠增重量显著大于未灌胃的。实验表明,大麦虫蛋白质酶解产物对小鼠良好的生长发育有一定的促进作用,且在给定剂量下,其增重量与灌胃该酶解产物的剂量呈正相关。

2.2 大麦虫蛋白质酶解产物对小鼠学习记忆能力的影响

Morris水迷宫实验是利用小鼠寻找隐藏在水中的休息场所来节约体力的本能,通过强迫小鼠学习寻找水中平台来测试其对空间位置感和方向感的学习记忆能力。因此,训练过程中小鼠找到平台的耗时越短,成绩越好;而测试过程中以潜伏期和反应次数作为小鼠空间定位学习和记忆能力的指标,潜伏期越短、反应次数越多,表明学习记忆能力越强。水迷宫实验的训练和测试结果的方差分析见表2和表3。

从表2中水迷宫实验的训练结果可得,第1d各组间的训练成绩无显著差异(p>0.05);比较1d和4d的数据可知,低、中、高剂量组比对照组小鼠的训练成绩提高幅度大38%～130.1%。提示经过4d的训练,基本在同一水平上的各组小鼠的训练成绩均有所提高,且灌胃了大麦虫蛋白质酶解产物的成绩提高幅度均大于未灌胃的,表明该酶解产物可提高小鼠的训练成绩。中剂量组第2d训练成绩与对照组差异显著(p<0.05),与低、高剂量组无显著差异(p>0.05);第3d的训练成绩与低剂量组无显著差异(p>0.05),与高剂量组差异显著(p<0.05),与对照组差异极显著(p<0.01);第4d的训练成绩与高剂量组差异显著(p<0.05),与低剂量组和对照组的成绩差异极显著(p<0.01)。而且比较1d和4d的数据可知,中剂量组小鼠的训练成绩提高幅度比低、高剂量组大21.5%～40.1%,提示中剂量为较适剂量,对小鼠学习能力的促进效果较好。

训练4d后,在第5d和第10d分别对小鼠进行了空间定位的学习记忆和遗忘程度的测试。通过表3可知,第5d对照组潜伏期比其他三组长19.1%～62.8%,极显著长于中、高剂量组(p<0.01),显著长于低剂量组(p<0.05);反应次数比其他三组少19.7%～76.1%,与中剂量组差异极显著(p<0.01)。第10d对照组潜伏期比其他三组长17.2%～39.8%,与中剂量组差异极显著(p<0.01);反应次数比其他三组少86.7%～164.3%(p<0.01)。提示大麦虫蛋白质酶解产物可提高小鼠的测试成绩,促进其学习记忆能力。第5d中剂量组的潜伏期极显著短于低、高剂量组(p<0.01);反应次数极显著多于低剂量组(p<0.01),显著多于高剂量组(p<0.05)。第10d中剂量组的潜伏期显著短于高剂量组(p<0.05);反应次数显著多于低、高剂量组(p<0.05)。通过分别比较各组小鼠5d和10d的测试成绩可知,中剂量组两次测试的潜伏期都是最短的,反应次数都是最多的。提示中剂量的大麦虫蛋白质酶解产物对小鼠学习记忆能力的保持促进效果最好。

研究表明,营养与学习记忆关系密切,学习记忆的过程需要食物中与各种营养素紧密相关的神经递质类物质的参与[22]。本实验中,灌胃大麦虫蛋白质酶解产物后小鼠的Morris水迷宫训练和测试成绩均显著高于对照的原因可能是,该酶解产物给小鼠的智力发育提供的生物活性肽是其促进小鼠学习记忆能力的主要成分。而关于大麦虫蛋白质酶解产物如何影响小鼠学习记忆能力的生理生化机制,如其如何影响海马脑源性神经生长因子的表达量及NMDA受体基因和CREB受体基因的表达量等[23],还有待进一步研究。

2.3 大麦虫蛋白质酶解产物对小鼠抗疲劳能力的影响

本实验以小鼠爬竿时间和负重游泳时间作为测量指标,来测定灌胃大麦虫蛋白质酶解产物30d后小鼠的体力。其中,负重游泳时间体现小鼠对抗运动疲劳的能力,爬竿时间体现其对抗静力疲劳的能力。小鼠爬杆实验和负重游泳实验测试成绩的方差分析见表4。

表4 小鼠爬杆实验和负重游泳实验测试成绩Table 4 Test results of pole test and weight loading swimming test

表4中,灌胃不同剂量大麦虫蛋白酶解产物后对照组负重游泳成绩比低、中、高剂量组低1.9%～16.4%,与低、中剂量组差异极显著(p<0.01)。中剂量组负重游泳成绩比其他三组高12.2%～14.1%(p<0.01);低剂量组成绩极显著高于对照组(p<0.01),显著高于高剂量组(p<0.05),高剂量组与对照组无显著差异(p>0.05)。提示灌胃小鼠该酶解产物的剂量与其对抗运动疲劳的能力有一定的关系,其中,中剂量更有利于提高小鼠抗运动疲劳的能力,低剂量对小鼠的该项能力也有一定的促进作用,高剂量的这项功效不明显。

灌胃不同剂量大麦虫蛋白酶解产物后对照组小鼠的爬竿成绩比低、中、高剂量组低6.2%～29.8%,与低、中剂量组差异极显著(p<0.01)。中剂量组爬竿成绩比其他三组高22.5%～23.0%(p<0.01);低剂量组成绩极显著高于高剂量组和对照组(p<0.01),高剂量组显著高于对照组(p<0.05)。提示灌胃小鼠该酶解产物的剂量与其对抗静力疲劳的能力有一定的关系,其中,中剂量提高小鼠抗静力疲劳能力的效果最好,低剂量效果其次,高剂量的这项功效不如低、中剂量。

已有研究表明,动物肌肉组织的能量主要来源于外源支链氨基酸,而大麦虫幼虫的氨基酸组成中有较多的支链氨基酸(占氨基酸总量的14.8%)[7]。在特殊的应急情况下,给小鼠灌胃的大麦虫蛋白质酶解产物为其补充了大量的外源支链氨基酸,这些支链氨基酸可以直接向小鼠的肌肉组织提供能量,减轻疲劳,同时使其机体更快地适应高强度的运动[24]。但从实验结果可知,高剂量的该酶解产物使小鼠的增重量增多反而导致了其抗疲劳能力的降低,因此,适量的该酶解产物才能更好地提高小鼠的抗疲劳能力。本实验的中剂量为大麦虫蛋白质酶解产物促进小鼠抗疲劳能力的较适剂量。

3 结论

昆虫资源丰富、虫体营养价值高,将其体内的营养成分采用水解酶技术处理后可以使其产品的品质、食品的营养和消化利用性能得到改善[25-27],可以有效的解决世界人口急剧增长带来的资源问题。本实验结果表明,灌胃大麦虫蛋白质酶解产物后小鼠的Morris水迷宫、爬竿和负重游泳测试成绩均显著高于对照,说明该酶解产物对其学习记忆能力和抗疲劳能力有一定的促进作用;而中剂量组的测试成绩均显著高于低、高剂量组,表明不同剂量该酶解产物对小鼠学习记忆和抗疲劳能力的提高程度不同,1.67g/(kg·d)的中剂量是提高小鼠这两项能力的较适剂量。上述研究结果初步证明了大麦虫蛋白质酶解产物具有促进KM小鼠学习记忆能力和抗疲劳能力的功效,为进一步探讨该酶解产物对动物智力及体力发育的影响,开发利用以大麦虫幼虫为原材料的功能性食品提供借鉴参考。

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Effect of protein hydrolysates fromZophobsmorioon learningand memory and anti fatigue abilities of mice

WANG Nan-xi,YANG Wei*,YANG Chun-ping,YANG Hua,YANG Xue-zhen,SHEN Yu-xi

(College of Forestry of Sichuan Agricultural University,Provincial Key Laboratory of Forest Protection,Ya’an 625014,China)

To investigate the effect of different doses ofZophobsmorioprotein hydrolysates on learning,memory and anti fatigue abilities,KM mice were intragastric administrated 30 days’ protein hydrolysates,through using Morris water-maze,climbing pole experiment and weight loading swimming test. Results showed that the incubation period of the control group without being administrated whose reaction times was 19.7%～164.3% less than the low,middle and high dose groups was 17.2%～62.8% longer than the other groups in the Morris water-maze,while the incubation period and reaction times of the middle dose group differed significantly from the control group(p<0.01). At the same time,the control group’s score of weight loading swimming test was 1.9%～16.4% lower than the other three groups and climbing pole experiment test was 6.2%～29.8% lower in the climbing pole experiment and weight loading swimming test,and the middle dose group got the significant higher results extremely than the low and high dose group(p<0.01). It suggested thatZophobsmorioprotein hydrolysates could enhance mice’s learning,memory and anti fatigue abilities which was significantly associated with the dosage intragastric administrated,of which moderate dosage(1.67g/(kg·d))was thought to be the most appropriate.

Zophobsmorioprotein hydrolysates;KM mice;learning and memory abilities;anti fatigue ability

2014-11-13

王南溪(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：昆虫资源开发与利用。

*通讯作者:杨伟(1964-)，男，博士，教授，研究方向：森林保护学。

四川农业大学“211”工程双支计划项目(00370101)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)05-0356-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.067