Cav-1在胰腺癌中表达及与临床预后关系的研究

单涛，郑波，陈熹，吴涛，白育花，季尔丽，王继欣

(西安交通大学医学院第二附属医院 普通外科，陕西 西安 710004)

·论 著·

Cav-1在胰腺癌中表达及与临床预后关系的研究

单涛，郑波，陈熹，吴涛，白育花，季尔丽，王继欣

(西安交通大学医学院第二附属医院 普通外科，陕西 西安 710004)

目的：肿瘤的发生发展不仅与肿瘤细胞的增殖有关，还依赖于肿瘤细胞和间质微环境之间的相互作用，对肿瘤微环境起关键调节作用的间质小窝蛋白-1(Cav-1)可能是一个潜在的治疗靶点，本研究旨在探讨胰腺癌间质Cav-1的表达能否作为客观的预后标志物。方法：选取45例胰腺癌标本，应用免疫组化法测定胰腺癌、癌旁及正常组织间质Cav-1表达，分析间质Cav-1的表达与临床病理特征和预后的相关性。结果:6例(13.3%)标本间质Cav-1呈强染色，8例(17.8%)呈低-中度染色，31例(68.9%)无染色。间质Cav-1表达缺失与TNM分期(P=0.018)、淋巴结转移(P=0.014)、远处转移(P=0.027)相关，与年龄、性别、组织学分级和肿瘤大小无显著性相关(P>0.05)。结论：胰腺癌间质Cav-1是独立预后指标，可作为胰腺癌有效治疗的靶标。

胰腺癌； 小窝蛋白-1； 预后； 免疫组织化学

胰腺癌是恶性程度较高的肿瘤之一[1]。研究表明，肿瘤微环境在肿瘤进展中起重要作用，突出了间质细胞在抗癌治疗中的重要性[2-4]。为了更充分地了解微环境在驱动肿瘤复发、转移以及决定临床预后的效用，发现新的微环境靶点非常重要。

小窝蛋白(Cav)是覆盖于50 nm至100 nm内陷细胞膜的一类骨架蛋白层[5]，Cav家族包含3个亚型：Cav-1、Cav-2、Cav-3。Cav-1基因位于7号染色体(7q31.1)，包括3个外显子(30、165、342 bp)和两个内含子(1.5、32 kb)。Cav-1蛋白参与多种细胞功能，如囊泡运输、胆固醇代谢和信号转导[6]。尽管越来越多的证据表明Cav-1与肿瘤发生相关，但是作为抑癌基因还是癌基因仍不清楚[7-9]。最近提出肿瘤代谢的自噬间质模型有助于对肿瘤微环境作用的理解[10-11]，在这个模型中Cav-1是潜在的关键靶点[12]。研究显示间质Cav-1的表达缺失是早期乳腺癌复发和进展的唯一独立预测因素[7]。Ayala等报道称，间质Cav-1表达缺失通过参与Akt的活化使TGF-β1和SNCG表达上调而导致前列腺癌细胞的转移[13]。有报道称癌相关成纤维细胞中Cav-1的表达水平可预测胃癌预后；而在恶性黑色素瘤转移灶中间质Cav-1表达缺失预示着不良预后[14-15]。然而，胰腺癌中间质Cav-1的表达水平和临床意义尚不清楚。为了探讨胰腺癌Cav-1表达的意义，我们检测其在胰腺癌间质中的表达水平，以便分析Cav-1的表达与胰腺癌临床病理特征及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2007年1月至2012年12月于西安交通大学第二附属医院肝胆胰外科进行胰十二指肠切除术(惠普尔术)的45例胰腺癌标本，10%福尔马林固定，正常胰腺组织作为对照。45例患者中，男24例，女21例，手术时平均年龄为64.5岁(44～82岁)。根据国际抗癌联盟的分类进行肿瘤分期和组织学分级的记录，其中Ⅰ期3例、Ⅱ期11例、Ⅲ期27例、Ⅳ期4例，组织学分级Ⅰ级7例、Ⅱ级20例、Ⅲ级18例。随访中位时间为22个月(4～52个月)，标本获得均经本人或近亲同意并签署书面知情同意书，本研究经西安交通大学的机构审查委员会和伦理委员会批准。

1.2 免疫组化检测Cav-1蛋白

采用标准的SP法检测Cav-1蛋白。组织切片经处理后与一抗孵育过夜，继而与生物素标记的羊抗兔IgG孵育30 min，随后与过氧化物酶标记的链霉亲和素室温孵育20 min。在含0.02% 3，9-二氨基联苯胺的Tris-HCl溶液(pH 7.6)中染色5～7 min，最后经苏木精复染、水冲洗、脱水、清除、封片，用显微镜观察。染色半定量评分为：阴性(0分，不着色)、弱阳性(1分，弥漫弱阳性或强阳性间质细胞数<30%)以及强阳性(2分，染色强阳性细胞数≥30%)。抗Cav-1 和β-actin均购自Abcam(Cambridge， USA或Santa Cruz， USA)。

1.3 统计学处理

采用χ2检验或双面Fisher精确检验分析方法。Pearson相关系数用来衡量Cav-1关联强度。采用Kaplan-meier计算生存率、log-rank检验进行差异性检验。选择有显著性的因素逐步建立Cox多元比例风险模型，以确定其预后价值。P<0.05为差异有统计学意义。所有的统计学分析采用SPSS 13(SPSS，Chicago)软件。

2 结 果

2.1 胰腺癌间质中Cav-1的表达

Cav-1在细胞膜和胞质中均有表达[16]，为了评估胰腺癌间质中Cav-1的表达状态，对胰腺癌、癌旁及正常组织均进行免疫组化检测。结果显示：Cav-1强表达几乎仅表达于癌旁及正常组织间质，在肿瘤组织间质仅偶尔检测到。45例肿瘤标本中，6例(13.3%)间质Cav-1呈强染色、8例(17.8%)呈低度染色、31例(68.9%)不着色(图1)。

N.正常胰腺组织； P.癌旁组织； C.胰腺癌组织

图1 免疫组化检测胰腺癌、癌旁、正常组织间质中Cav-1表达水平 ×400

N．Normal tissue strongly positive for Cav-1 expression; P.Paracancer tissue moderate for Cav-1 expression; C. Tumor tissue with negative Cav-1 expression

Fig 1 Representative immunohistochemistry results of stromal Cav-1 expression in pancreatic tissue(×400)

2.2 间质Cav-1表达缺失与临床病理参数的关系

表1总结了胰腺癌间质中Cav-1蛋白的表达与临床病理参数的联系。Ⅰ、Ⅱ期的14例中6例(42.9%)间质Cav-1表达缺失，显著低于Ⅲ期(77.8%，21/27)和Ⅳ期(100%，4/4)(P=0.018)。间质Cav-1的表达缺失与淋巴结转移(P=0.014)、远处转移(P=0.027)相关，与年龄、性别、组织学分级和肿瘤大小无显著相关性(P>0.05)。

2.3 间质Cav-1表达缺失与胰腺癌预后相关性

为明确胰腺癌间质Cav-1缺失的预后价值，对Cav-1不同表达状态的患者累积生存率进行分析(图2)，间质Cav-1表达缺失，即无染色，定为阴性，弱染色或强染色定为阳性。间质Cav-1阴性患者(n=31)3年累积生存率为8.8%(中位时间16个月)，相反地，Cav-1阳性患者(n=14)的累积生存率为20.2%(中位时间28个月)，差异有统计学意义(P<0.05)。

多因素分析显示，淋巴结转移和TNM分期是胰腺癌患者总生存期的独立预后因素，间质Cav-1蛋白的表达缺失也是总生存期的独立预后因素(P=0.006)，然而肿瘤大小等临床参数不是独立的预后因素。

3 讨 论

实体肿瘤进展除细胞内在特性外，还得益于肿瘤周围丰富的炎症细胞和间质细胞交互作用[17]，暗示肿瘤的治疗应同时针对肿瘤细胞及间质细胞[18]。肿瘤代谢自噬间质模型[19]表明作为关键调节剂的间质Cav-1表达缺失是潜在的治疗靶向，且进一步表明间质细胞Cav-1的表达可能具有预测预后价值。此外，间质Cav-1表达缺失已证实是乳腺癌早期复发、淋巴结转移、他莫昔芬耐药和不良临床预后的预测因子[20]。本研究结果显示与癌旁和正常组织相比，间质Cav-1在胰腺癌中表达下调，其表达缺失与高TNM分期、淋巴结转移、远处转移和不良预后相关。本研究首次表明间质Cav-1的表达缺失是胰腺癌的不良预后指标。然而，Witkiewicz等[21]的研究表明，FASN和Cav-1的共表达可能是有价值的临床指标，他们发现Cav-1和FASN在胰腺低分化腺癌中表达高于胰腺导管上皮内瘤变中的水平。除肿瘤上皮细胞外Cav-1也存在于肿瘤相关成纤维细胞中，间质Cav-1在正常胰腺或邻近肿瘤细胞的慢性胰腺炎组织中为阴性，这与本研究结果不一致。这种差异可能归因于Witkiewicz等研究中两分子(FASN和Cav-1)免疫定位中的互相干扰，而且，研究中的Cav-1抗体特异性有差异。最后，标本的异质性可能也会影响结果。鉴于Witkiewicz等的研究结果与本研究不一致，仍需进一步的探索。

Cav-1蛋白是细胞膜穴样内陷的结构蛋白，存在于大多数哺乳动物细胞中[22]。Cav-1蛋白是细胞小窝的主要结构蛋白，并被认为是参与细胞恶性转化和恶性进展的关键分子[23]。Cav-1在几条导致细胞转化的信号通路中起重要的调节作用，包括由Src家族酪氨酸激酶、表皮生长因子受体、HER-2/neu、C反应蛋白、Wnt信号和Erk1/2介导的信号转导[6，24-26]。根据肿瘤的类型和(或)分期，Cav-1被认为是抑癌基因或癌基因。这两种不同的作用可能是因为Cav-1不同结构域的不同激活状态影响，或是由信号通路中与Cav-1蛋白相互作用的分子的表达所致[27]。最近，有几项研究对Cav-1蛋白在肿瘤进展中的潜在作用进行了评估[8，28-30]，然而，Cav-1的表达与肿瘤进展之间的关系在细胞和分子水平仍不清楚。基于肿瘤代谢自噬间质模型，Cav-1蛋白表达缺失可能通过代谢转化机制而影响肿瘤进展，这值得进一步的研究。

表1 胰腺癌间质Cav-1表达与临床病理因素关系 例

Tab 1 Association between stromal Cav-1 expression and clinicopathologic factors in pancreatic cancers cases

aP<0．05

注：括号中为所占百分比

总之，间质Cav-1蛋白在胰腺癌中表达下调，且与高TNM分期、淋巴结转移和不良预后紧密相关，因此，间质Cav-1可作为胰腺癌侵袭性的新的生物标志物。

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图2 胰腺癌间质Cav-1表达阳性和阴性患者生存曲线图

Fig 2 Kaplan-Meier analysis of the overall postoperative survival curves in patients with pancreatic cancer according to immunohistochemical staining as positive or negative of stromal Cav-1 expression

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Loss of stromal caveolin-1 expression:a novel tumor microenvironmentbiomarker that can predict poor clinical outcomes for pancreatic cancer

SHAN Tao，ZHENG Bo，CHEN Xi，WU Tao，BAI Yu-hua，JI Er-li，WANG Ji-xin

(DepartmentofGeneralSurgery，theSecondAffiliatedHospitalofMedicalCollege，Xi’anJiaotongUniversity，Xi’an710004，China)

Objective: Cancer development and progression is not only associated with the tumor cell proliferation but also depends on the interaction between tumor cells and the stromal microenvironment. A new understanding of the role of the tumor microenvironment suggests that the loss of stromal caveolin-1 (Cav-1) as a key regulator may become a potential therapy target. This study aims to elucidate whether stromal Cav-1 expression in pancreatic cancer can be a strong prognosis biomarker. Methods: Tissue samples from 45 pancreatic cancer patients were studied. Stromal Cav-1 expression was measured from pancreatic cancer， paraneoplastic， and normal tissue by using immunohistochemistry. We analyzed the correlation of stromal Cav-1 expression with clinicopathologic features and prognostic. Results: Specimens from six patients(13.3%) showed high levels of stromal Cav-1 staining， those from eight patients(17.8%) showed a lower， intermediate level of staining， whereas those from 31 patients (68.9%) showed an absence of staining. Stromal Cav-1 loss was associated with TNM stage(P=0.018)， lymph node metastasis(P= 0.014)， distant metastasis(P= 0.027). The relationships of age， sex， histological grade， and tumor size with stromal Cav-1 expression were not significant(P>0.05). Conclusion: The loss of stromal Cav-1 in pancreatic cancer is an independent prognostic indicator， thus suggesting that stromal Cav-1 may be an effective therapeutic target for patients with pancreatic cancer．

pancreatic cancer； caveolin-1； prognosis； immunohistochemistry

2015-03-04

2015-04-12

国家自然科学基金资助项目(81402583)； 陕西省自然科学基金资助项目(2014JQ4165)； 西安交通大学校基金资助项目(xjj2014077)

陈熹 E-mail:Chenxi@163.com

单涛,郑波,陈熹,等.Cav-1在胰腺癌中表达及与临床预后关系的研究[J].东南大学学报:医学版,2015,34(4):552-557.

R735.9

A

1671-6264(2015)04-0552-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．012