苏枸杞快繁体系建立

陈晓丹，李爱民，张正海，张悦

(中国农业科学院特产研究所，长春 130112)

苏枸杞(LyciumruthenicumMurr.)属茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)植物，俗称黑果枸杞[1]，是分布于我国青海、新疆、内蒙古、陕西、甘肃和西藏等西北部地区的一类珍贵浆果植物[2]；苏枸杞适应性强，喜光、耐寒、耐干旱、耐盐碱[3]，是我国西部地区特有的沙漠药用植物[4，5]。苏枸杞果实中富含花青素，是迄今为止发现原花青素含量最高的野生植物，具有清除氧自由基、滋补肝肾、益精明目、增强免疫功能、防治癌症、抗衰老和美容等功能，被誉为“软黄金”[6]，售价较高。近年来，随着野生苏枸杞药用保健产品的开发，凸显出巨大的经济价值，导致这一宝贵野生资源的面积大大减少，当地生态环境遭人为破坏，已初步呈现一定的资源与环境问题。针对这一现状，为了更好地保护西部地区生态环境和利用苏枸杞这一珍贵资源，满足现代化农业的发展需求，本研究通过组织培养建立了苏枸杞快速繁殖体系，解决了其苗木繁育的问题[7]，为其大面积栽培提供了技术依据。现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

本试验在中国农业科学院特产研究所实验基地进行。试验材料为2014年1月从甘肃省永靖县引进的苏枸杞，其插条在室内进行盆栽培养。

1.2 方法

1.2.1外植体处理待盆栽苏枸杞萌发抽生新枝后，取幼嫩茎段为外植体，先用适量洗衣粉液浸泡10min，再以流水冲洗12h；于超净工作台上，先用75%酒精消毒30s，无菌水冲洗3次；再用0.1%升汞溶液消毒5min，无菌水冲洗5次。将灭菌的茎段接种到起始培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L)上，置于光下培养，室温25±3℃，光照强度2000lx，光照时间14h/d。

1.2.2增殖继代培养将“1.2.1”项中诱导形成的芽转接于增殖培养基上，同时附加不同浓度的6-BA(0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L)和NAA(0.01mg/L、0.02mg/L、0.03mg/L)，每处理接种10瓶，每瓶接3芽，30d后观察生长状况，并统计各处理芽的分化率。

1.2.3生根培养选取株高2cm以上生长健壮的小植株，接种于改良的1/2MS培养基上，附加不同浓度的IBA(0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L)和NAA(0mg/L、0.01mg/L、0.1mg/L)，每处理接种12瓶，每瓶3株，25d后统计各处理生根率。

1.2.4炼苗移栽当根长至2cm～3cm时，将生根苗分别进行3d、7d和10d炼苗，后以细河沙与腐殖土(比例为1∶3)作为移栽基质；基质在移栽前1天用0.2%高锰酸钾溶液消毒基质并覆膜24h；移栽后加强微环境调控，以提高成活率。

1.2.5数据分析数据采用SAS软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 增殖培养

将诱导产生的芽转接到增殖培养基上，经30d培养，在芽的周围均能形成一定数量的不定芽。植物生长调节物质在植物组织培养中有关键作用，虽然用量少，但它们对外植体的诱导萌发以及生根等器官分化具有重要的调节作用。结果表明，不同6-BA和NAA浓度组合对苏枸杞的增殖效果有显著影响。当6-BA浓度一定时，随着NAA浓度的升高，组培苗增殖系数逐渐降低。当6-BA浓度为0.2mg/L、NAA浓度为0.01mg/L时，增殖系数最高，可达9.27(图1、图2和表1)。

图1 苏枸杞腋芽萌发

图2 增殖培养

表16-BA和NAA激素配比对丛生芽增殖的影响

Table1Effectofvarioushormoneonadventitiousbudnumber

6-BA(mg/L)NAA(mg/L)接种数(个)Inoculatednumber平均增殖系数Averagegrowthmodulus0.10.01305.50cde0.10.02306.39c0.10.03305.94cd0.20.01309.27a0.20.02308.06b0.20.03304.56ef0.30.01305.39cde0.30.02303.78f0.30.03305.06de

注：小写字母表示α=0.05水平下差异显著性，同列不同字母表示差异显著。下同。

Note：Small letter represents significance at 0.05.Different letter within one column showed significance at 0.05 levels by Duncans LSD test.The same as below.

2.2 生根培养

将株高2cm以上的小植株接种到生根培养基上，7d后开始生根，25d后大量生根。结果表明，不同处理间差异显著。当NAA浓度一定时，生根率与根数随着IBA浓度的升高而分别提高和增加，说明添加IBA促进生根。组培苗根数越多，根对养分的吸收面积越大，那么生根苗的长势越好，将来移栽成活的几率也会大大增加。当生根培养基中添加IBA 0.1mg/L+NAA 0.2mg/L时，植株生根率最高，可达72.2%，且植株生长健壮(图3和表2)。

图3 诱导生根

表2不同IBA和NAA浓度对生根的影响

Table 2 Effect of different concentrations of NAA and IBA on rooting

2.3 炼苗移栽

当根长至2cm～3cm时，把培养瓶移到室温条件下炼苗，使其能逐步适应外界的环境变化，增加成活率。不同的炼苗时间间组培苗的移栽成活率差异显著。炼苗时间为3d时，组培苗木质化程度低，仍处于“自养”状态，因此，较难适应瓶外的环境，成活率仅为24%；炼苗时间为10d时，培养基容易受到外界有菌环境的污染，并且，培养基中水分蒸发，根部培养基干燥，较难清洗干净，根部残留的培养基容易引起移栽苗烂根死亡，使成活率降低；炼苗时间为7d时，组培苗已经完成驯化且培养基较易清洗干净，移栽苗的成活率最高，可达83%。以细河沙与腐殖土混合作为移栽基质，并用0.2%高锰酸钾溶液消毒，移栽后保持空气湿度和温度，覆膜养护，成活率可达80%以上(图4和表3)。

图4 幼苗移栽

表3炼苗时间对移栽成活率的影响

Table3Effectofacclimatizationtimetosurvivalrate

炼苗时间(d)Acclimatizationtime处理数(个)Treatmentnumber成活率(%)Survivalrate310024.0c710083.0a1010059.0b

3 讨论与结论

3.1 讨论

苏枸杞是名贵的中药材和滋补保健食品，越来越受到人们的重视，产品售价较高且供不应求，而人们粗放采摘果实，导致树体被破坏和资源锐减，当地生态环境遭受严重破坏。本研究从保护资源入手，建立了苏枸杞组培快繁体系，为其可持续利用提供了技术储备。

研究中发现，苏枸杞茎段诱导时存在玻璃化现象，这是培养过程中所特有的一种生理失调或生理病变，主要是瓶内气体交换受阻、外植体生长量过大、温度过高、湿度过大以及细胞分裂素的浓度过高等环境因素所致。罗青等[7]研究了引起枸杞组培苗玻璃化因素，认为6-BA 0.2mg/L、蔗糖3%、琼脂6.5mg/L、培养温度25℃、在2000lx光照强度下接受12h的光照，可以有效减少玻璃化苗的发生。本研究中也产生了少量的玻璃化苗，可能是由于培养温度过高、琼脂含量略低、细胞分裂素浓度过高等造成的。

植物激素是影响组织培养快繁的重要因素，其成分、浓度和配比都会对细胞的分化和器官的发生产生很大的影响[8]。本研究以MS为基本培养基，添加较低浓度的6-BA(0.2mg/L)和NAA(0.01mg/L)，获得了较高的增殖率。陈正华[9]认为，生长素浓度过高会抑制木本植物芽的增殖，以较低浓度为宜。

NAA和IBA被广泛应用于生根培养过程中，孙书伟等[10]认为，IBA能显著提高蓝莓组培苗瓶内的生根率；戴云新等[11]研究结果表明，NAA诱导非洲菊组培苗的根肥大、粗短，而IBA诱导的根相对较长。本研究中，进行苏枸杞生根预试验时，在1/2MS培养基中只添加了NAA，结果组培苗基部形成巨大的根瘤状组织，生根效果很差，随后，又增添了不同浓度的IBA联合使用促进生根，取得了较好的效果，这可能是因为多种激素共同作用才能很好地完成细胞的分化和器官的形成。

3.2 结论

以苏枸杞幼嫩茎段作为外植体进行组织培养，在MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L上诱导萌发；适宜增殖培养基为MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L；适宜的生根培养基为1/2MS+IBA 0.1mg/L+NAA 0.2mg/L；最佳的炼苗时间为7d，移栽基质为细河沙与腐殖土(比例为1∶3)，0.2%高锰酸钾溶液消毒24h，移栽成活率可达80%以上。

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