拟南芥Atlg52910突变体的鉴定与初步分析

戚晓利，吴玉德，梁英辉，穆 丹，申 健，韩诚武，田 蕾，卢孟柱

(1.佳木斯大学 生命科学学院，黑龙江 佳木斯154007；2. 中国林业科学研究院 林木遗传育种国家重点实验室，北京100091)

拟南芥Atlg52910突变体的鉴定与初步分析

戚晓利1,2，吴玉德1，梁英辉1，穆 丹1，申 健1，韩诚武1，田 蕾1，卢孟柱2

(1.佳木斯大学 生命科学学院，黑龙江 佳木斯154007；2. 中国林业科学研究院 林木遗传育种国家重点实验室，北京100091)

在筛选与维管发育相关的拟南芥突变体过程中，发现拟南芥DUF1218家族At1g52910基因突变体的花器官明显异常。通过基因型分析筛选到纯合突变体，TAIL-PCR分析结果表明突变体为Ds单位点插入突变，突变体后代表型出现分离现象，暗示有其它突变位点存在。

拟南芥；Atlg52910；TAIL-PCR；花器官变异

拟南芥在适当的诱导条件下也能形成类似“木材”的维管组织[1-3]，因而可以借助拟南芥丰富的基因资源研究木材形成的分子机制。课题组利用前期建立的毛白杨次生维管系统再生实验体系，通过拟南芥表达谱芯片分析再生过程中的基因表达变化，获得差异表达基因[4]。对差异表达基因的拟南芥突变体进行筛选，发现一个属于DUF1218基因家族Atlg52910的突变体出现了明显的表型变化，主要表现为花器官变异。为了探明这些变异是否是因为外源基因插入引起的，对突变体的进行纯杂鉴定和遗传分析，用TAIL-PCR方法扩增出T-DNA插入位点的侧翼序列。

1 材料和方法

1.1 材料

拟南芥突变体ET139购自拟南芥突变体资源中心(The Nottingham Arabidopsis Stock Centre，NASC)；野生型拟南芥(ArabidopsisthalianaLandberg)种子由中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥的基因组DNA提取

采用CTAB法[5]。

1.2.2 纯合突变体的鉴定

采用三引物法。PCR所用引物出自SIAGnAL(http://signal.salk.Edu/isectprimers.html)，引物分别为：Ds3：5′-ACCCGACCGGATCGTATCGGT-3′；LP：5′-CGGTCACAAGTCTCTTGACATTTTCGTC-3′；RP：5′-CTTGTTCTGGATCTCACTACTCACTA-3′。PCR反应条件：94 ℃，5min；(94 ℃，30 sec，56 ℃，30 sec；72 ℃，1min)35个循环；72 ℃，7 min，1.0%琼脂糖胶电泳分析。

1.2.3 TAIL-PCR

利用TAIL-PCR从突变体DNA中扩增插入位点的旁侧序列，参考 Liu等报道的方法[6]。

1.2.4 测序及序列分析

PCR产物直接与pGEM-T Easy(Promega)克隆载体连接，转化大肠杆菌，每个样品挑选2个阳性克隆送到上海生工生物工程有限公司测序。将测序后的基因序列与拟南芥基因组数据库(http://www.arabidopsis.org/servlets/sv)比对。

2 结果和分析

2.1Atlg52910的突变体花器官的变异

拟南芥为十字花科植物，花器官构造通常包含4轮，从外到内依次为花萼、花瓣、雄蕊和心皮。Atlg52910突变体ET139变异主要表现为不同程度的花瓣缺失。根据花瓣缺失程度的大小，可以分为花瓣部分缺失和花瓣完全缺失(图1)，同一植株发育后期个别花出现花瓣(图1-c)。

图1 突变体ET139花器官的变异

2.2 纯合突变体的鉴定

利用拟南芥突变体库提供的检测方法(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.html)，对Ds插入引起的突变进行纯杂合检测。在插入位点两端设计引物LP和RP，二者组合能在野生背景下扩增出1153bp片段，而RP与Ds上的Ds3引物组合能够扩增出637bp片段。分别提取突变体表型正常与异常叶片基因组DNA，进行PCR分析，野生型只能扩出1153bp片段，突变体只能扩出637bp片段，表明突变体均为纯合体(图2)。

图2 突变体PCR纯杂检测

2.3 突变体遗传分析

突变纯合体经多代种植后突变表型稳定出现，表明其表型具有遗传基础，非偶然现象。同一突变体后代表型出现分离现象，除出现突变表型外，有正常表型的植株出现，说明表型并非由Ds插入Atlg52910引起的。

2.4 TAIL-PCR

为了明确是否Ds有其它插入位点，采用引物组合从Ds3′端和5′分别进行TAIL-PCR扩增侧翼序列，发现在Ds3-1(Ds5-1)/Ds3-2(Ds5-2)/Ds3-4(Ds5-4)和AD组合条件下可以获得清晰的条带，且第3轮扩增产物比第2轮扩增产物偏小，符合TAIL-PCR技术的原理(图3)。将第3轮PCR产物经电泳检测后，回收目的条带并克隆转化测序。随机引物选用了13种AD1～AD13，图3中显示Ds3′端引物与TAIL-PCR随机引物AD1～AD8 PCR电泳结果。在阳性克隆测序后获得了大小不同的侧翼序列，其结果一致，检测出的侧翼序列均为Atlg52910，没有发现其它插入位点。Ds插入其第二外显子中(图4)，与TAIR网站上公布结果相符。

图3 TAIL-PCR结果的电泳分析

图4 Ds插入Atlg52910位点的示意图

Atlg52910由3个外显子和2个内含子组成，Ds插入位点在第2外显子处，下划线代表Ds插入位点两端11bp反向重复序列。

3 讨 论

利用植物基因突变的方法研究植物基因的功能是认识生命活动机理的一种有效途径。植物基因突变后失去功能或功能发生改变，有可能使某些代谢途径部分或完全发生变化，从而产生相应的可见的表型变化，据此就可以推测出突变基因的功能，而突变基因的鉴定是研究突变体的首要任务。本课题组在突变体筛选过程中获得一花器官异常Ds转座突变体，纯杂鉴定发现表型与基因型不一致，说明表型与Ds插入突变无关。通过TAIL-PCR克隆侧翼序列，分析没有发现其它的Ds插入位点。突变体多代种植后其突变表型稳定出现，说明表型具有遗传基础，导致表型出现的遗传因素尚需进一步研究，可通过图位克隆法获析突变位点，该结果对于突变体后续变异研究有一定的意义。

[1] CHAFFEY N, CHOLEWA E, REGAN S，et al. Secondary xylem development in Arabidopsis a model for wood formation[J]. Physiologia Plantarum, 2002,114:594-600.

[2] KO J H, HAN K H, PARK S, et al. Plant body weight-induced secondary growth in Arabidopsis and its transcription phenotype revealed by whole-transcription profiling[J]. Plant Physiology,2004,135:1069-1083.

[3] LEV-YADUN S. Induction of sclereid differentiation in the pith of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh[J]. Journal of Experimental Botany.1994,45:1845-1849.

[4] 杨海峰,王敏杰,赵树堂,等.利用拟南芥基因芯片和突变体对木材形成相关基因的初步分析[J].林业科学, 2011,47(12):36-42.

[5] DOYLE J J, DOYLE J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochemical Bulletin, 1987, 19(1):11-15.

[6] LIU Y G, MITSUKAWA N, OOSUMI T, et al. Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR[J]. Plant Journal, 1995,8(3):457-463.

Identification and Preliminary Analysis of GeneAtlg52910 Mutants

Qi Xiaoli1,2, Wu Yude1, Liang Yinghui1, Mu Dan1, Shen Jian1, Han Chengwu1, Tian Lei1, Lu Mengzhu2

(1.College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China；2.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China)

In the screening associated with vascular development inArabidopsismutants (Atlg52910) process, a mutant of DUF1218 genes is obtained exhibiting floral aberrance. Homo-and heterozygosity identification was performed on mutants, and the results showed insertional mutant of theAtlg52910 gene is inconsistent with the mutant phenotype. The result of TAIL-PCR analysis did not find out the otherDsinsertion sites, which suggested there are other mutations existence.

Arabidopsisthaliana；Atlg52910；TAIL-PCR；floral aberrance

2015-04-18

佳木斯大学科学技术重点项目(Sjz2012-19)；黑龙江省教育厅科学研究项目(12513091)；黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(201410222040)。

戚晓利(1971—)，女(汉族)，副教授，博士。研究方向：分子生物学教学及科研。E-mail：qixiaoli3@tom.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.06.005

Q78

A

1006-9690(2015)06-0018-02