“O”型口蹄疫正向间接血凝试验的操作体会

刘俊青 山西省长治市郊区畜牧兽医局 046000

正向间接血凝试验是目前我国各地动物防疫监督机构对口蹄疫进行免疫抗体水平检测广泛采用的试验方法。该方法具有操作简易、快捷、特异、既可定性又可定量等优点，所需试验设备简单，具备一般条件的实验室即能完成实验操作。但是实验结果受操作技术影响很大，保证实验操作的细节是获取正确结果的关键所在。

1 原理

抗原与其对应的抗体相遇时，在一定条件下会形成抗原抗体复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。若将抗原吸附在（致敏）经过特殊处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体的反应灵敏性。这种经过口蹄疫纯化抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。在间接血凝试验中，红细胞具有抗原载体和指示剂的双重作用。

2 实验器材

本实验所使用的实验器材包括微量血凝板、微量振荡器和8 道移液器。为了保证实验的顺利进行，要选择质量有保障、稳定性好的器材。

（1）微量血凝板。96 孔110°V 型医用血凝板，此板可以叠放，但每次用完需要清洗。清洗方法：用过的血凝板应及时用高压清水冲净，再用5%的盐酸浸泡48 小时，最后用蒸馏水或去离子水冲洗2次，甩干板子倒置于37℃温箱中烘干备用。用前要先检查血凝板孔底是否干净，如发现有透光性差一点的孔，可用酒精棉签擦净。

（2）微量振荡器。使用振荡器振荡时间不宜超过1 分钟，振荡强度不能太大，多块板叠加后振荡时要用手压住最上一板，以防上下的振动造成孔中液体溅出而影响实验结果的准确性。

（3）单、多道微量移液器。建议使用高质量的移液器，吸取液体时动作要轻缓，防止气泡产生。移液器属精密器械，用完后需用75%的酒精棉擦拭，并把刻度调到最大值。

（4）吸嘴。吸嘴多为一次性消耗品。

3 试剂

（1）抗原。正向血凝抗原摇匀后呈棕红色或咖啡色，无块状物沉淀，静置后血球逐渐沉入瓶底。摇匀后能很快形成均匀混悬液体，摇匀后仍有小块黑色沉淀物（血球团）的抗原，建议不要使用。1 瓶抗原可以检测18～20 份血清。抗原2~8℃保存，保存期3 个月，切勿冻结。

（2）对照血清。阴性对照血清呈淡黄色液体，阳性对照血清呈微红或淡黄色稍浑浊液体。一般情况下2～8℃保存，保存期为3 个月。

（3）稀释液。稀释液无色透明，低温下放置，瓶底易析出少量结晶，在水浴中加温后即可全溶。一般情况2~8℃保存，保存期3 个月。

4 样品血清

待检血清要保证新鲜、清亮透明，未检血清在-20℃保存。同时避免血清反复冻融影响检测结果。

5 实验过程

正向血凝实验过程包括：加稀释液、稀释待检血清、稀释阴阳性血清、加血凝抗原、震荡静置和结果判定。在试验中要注意以下问题。

（1）加稀释液。在血凝板上1~7 排的1~10 孔、第8 排的1~4 孔和第5～7 孔，加稀释液50μL/孔。

（2）稀释待检血清。取待检灭活血清样品50μmL，分别加入反应板1～6 排的第1 孔中，于稀释液混匀后吸取50μL 加入第2 孔，依次作2 倍系列稀释至第10孔，第10 孔混匀后取出50μL 弃去。此时第1 排1~10孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为1∶2、1∶4、1∶8……1∶256 和1∶1024。每个待检血清样品均按上述方法稀释。在稀释血清操作时避免产生过多气泡，注意每取一份血清必须更换吸嘴。

（3）稀释阳性对照血清。在血凝板上的第7 排第1 孔加阳性血清50μL，2 倍系列稀释至第10孔。混匀后从该孔取出50μL 丢弃。此时阳性血清的稀释倍数依次为1∶2、1∶4、1∶8……1∶1024。

（4）稀释阴性对照血清。在血凝板上的第8 排第1 孔加阴性血清50μL，对倍稀释至第4 孔。混匀后从该孔取出50μL 丢弃。此时阴性血清的稀释倍数依次为1∶2、1∶4、1∶8 和1∶16。第5～7 孔为稀释液对照孔，每孔仅加入50μL 稀释液。

（5）加血凝抗原。待检血清各孔、阴阳性对照各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原(充分摇匀，瓶底应无血球沉淀)25μL/孔。一次实验过程应选择同一批号的抗原，并先从稀释度高的孔加起，避免滴头和孔内的液体直接接触。

（6）振荡混匀。将反应板置微型振荡器上震荡2～3 分钟，然后在白色背景下观察直至血球分布均匀，封板膜封板，室温下静置1.5～2 小时或将板置冰箱中冷藏延至次日判定结果。

6 判定标准

以呈现“++”血凝反应的血清最高稀释度作为该血清的间接血凝抗体效价，血凝反应强度如下:“++++”红细胞全部凝集，形成一层均匀膜，布满整个孔底；“+++”红细胞在孔底形成一层薄膜，面积比前者略小；“++”红细胞在孔底形成薄膜凝集，边缘松散或呈锯齿状；“+”红细胞在孔底形成稀薄、散在的少量凝集，孔底有小圆点。

7 值得探讨的问题

收到试剂盒应立即打开包装，取出血凝抗原瓶，用力摇动，使粘附在瓶上的红细胞摇下，否则易出现沉渣，影响使用效果；勿用90°和130°血凝板，严禁使用一次性血凝板，以免误判结果；严重溶血或严重污染的血清样品不易检测，以免发生非特异性反应；抗原为悬浮液，每次滴加前应充分摇匀，并先从稀释度高的孔开始加起，同时避免滴头和孔内的液体直接接触；当阳性血清抗体效价≥1∶256、阴性血清抗体效价≤1∶16、稀释液对照孔无自凝现象时实验成立；待检血清使用前，需经过56℃水浴灭活30 分钟；如果使用不同生产批号的红细胞抗原复合物来检测同一血清，应先测出这些血凝抗原的效价，然后将效价相同的抗原作为血液抗体检测之用，这样就可以保证结果的准确性，若血凝抗原效价差别较大，则可导致检测结果出现误差甚至错误。