葡萄属植物抗旱相关基因研究进展

李 菲 ，颜培玲 ，潘学军 ，张文娥

（1.贵州大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州省果树工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025）

葡萄（Vitis viniferaL.）是世界第二大水果，拥有悠久的栽培历史，种类繁多，具有重要的食用价值和经济价值，目前生产上主推的许多葡萄栽培品种抗逆性、抗病虫能力均较差。且近年来，随着全球气候的恶变，世界各地干旱事件频繁发生，在非干旱季节或非干旱地区干旱危害也频繁出现[1]。干旱（Drought）对葡萄生长发育过程和产量品质有严重的影响，已经成为制约葡萄生长和提高果品质量的主要因素之一，尤其是近年来全球气候的变化和我国南方干旱的频频出现，使葡萄产业受到很大的威胁。在世界范围内都面临缺水问题的大背景之下，发掘抗旱葡萄资源、研究葡萄抗旱基因对提高葡萄抗旱性、培育抗旱新品种及节水栽培等都具有重要的科学价值和意义。本文对与葡萄抗旱相关的基因的功能和调控进行较全面的综述，有助于对葡萄抗旱分子机制的理解。

葡萄的抗旱性（Drought resistance）是由多基因控制的数量性状，对干旱等逆境应答和适应需要多个基因的参与，且受到多种途径的调控。在轻度干旱胁迫时，渗透调节是植物体适应水分亏缺的主要途径，植物一方面提高合成渗透调节物质相关酶基因的转录水平，促进基因的表达，增加表达产物的积累；另一方面植物增强抗氧化、解毒相关酶基因（如SOD、CAT、GST等）的表达水平。当胁迫强度超出渗透调节的能力时，LEA蛋白及糖类的脱水保护物质积累，保护生物大分子和生物膜系统免受损害。由此，葡萄的抗旱能力取决于自身的组织结构和生理特性，归根结底在于分子水平的差异。随着葡萄全基因组序列的公布，许多与干旱胁迫相关的基因及其调控因子已经得到分离与克隆，并转化到葡萄或模式植物中并对其功能进行分析和验证。响应干旱胁迫的基因根据其功能可分为两类：一类是直接参与提高葡萄抗旱能力起保护作用的功能基因；另一类是主要对信号传导和基因表达的过程起调节作用的调控基因。

1 葡萄抗旱相关的功能基因

这类基因的表达产物能直接维持细胞的各种理化代谢活动的正常进行。目前在葡萄研究中涉及的这一类基因主要包括渗透调节因子的合成酶基因、直接保护细胞免受水分胁迫损伤的功能蛋白基因及毒性降解酶基因等。

1.1 渗透调节物质合成相关基因

渗透调节物质是指植物在干旱或盐碱等逆境胁迫下，为消除胁迫所造成的伤害维持体内的水分和渗透平衡，在细胞中产生或积累的小分子有机化合物，主要包括脯氨酸、多胺等氨基酸及其衍生物，果聚糖、海藻糖等低分子糖类，甘油、甘露醇、山梨醇等多元醇，渗调蛋白等。目前，干旱胁迫下，在葡萄中发现起渗透调节作用的主要是脯氨酸和多胺。

1.1.1 脯氨酸合成相关基因

脯氨酸（Proline）是在高等植物中广泛存在的组成性氨基酸，具有水溶性，是植物中主要的渗透调节物质之一，它能聚集与渗透调节有关的蛋白，避免或减少因细胞失水引起的蛋白质变性。在盐、干旱和低温等逆境胁迫下，多数植物体内会积累较高水平的游离脯氨酸，从而起到渗透调节的作用。与脯氨酸合成相关的基因主要有吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）、吡咯琳-5-羧酸还原酶基因（PSCR）、鸟氨酸-6-氨基转移酶基因（OAT）和脯氨酸脱氢酶基因（ProDH）。其中吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）已在葡萄中克隆出来，其登录编号为CBI31612[2]，在其他植物中有关P5CS基因调控脯氨酸合成积累进而提高其抗旱性的研究较多，但P5CS基因与葡萄抗旱性关系的报道较少。

1.1.2 多胺合成相关基因

多胺（Polyamine）是生物体的氮素类细胞组分，多胺的多聚阳离子使其在众多植物体内发挥着重要的生理活性功能，如酸中和、抗氧化以及维持细胞膜系统的稳定性等。植物在干旱、高盐等逆境条件下可积累多胺。多胺生物合成过程中的关键基因有小鼠鸟氨酸脱羧酶编码基因（ODC）和燕麦精氨酸脱羧酶编码基因（ADC）。Liu等[3]将葡萄幼苗用氯化钠和甘露醇处理后，获得4种多胺合成基因，它们分别是精氨酸脱羧酶基因（pVvADC）、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因（pVvSAMDC）、亚精胺合成酶基因（pVvSPDS）、精胺合成酶基因（pVvSPMS），其中pVvADC是在盐处理1d后获得，pVvSAMDC和pVvSPMS表达较晚，是在胁迫后期表达，这些基因的获得表明植物周围的渗透压提高水分缺少时为了抵御逆境环境的胁迫，通过基因表达合成多胺以维持植物体细胞膜系统的稳定性抵御外界不良环境。

1.2 响应水分胁迫损伤的功能基因

当植物受到干旱胁迫超出其渗透调节范围时，有些植物可以产生具有脱水保护功能的有机物，保护生物大分子及膜系统免受脱水造成的危害，植物在干旱胁迫解除后便能恢复生长。主要包括水通道蛋白（AQP）、脱水响应基因（RD）和晚期胚胎丰富蛋白（LEA）等有机物。

1.2.1 水通道蛋白相关基因

水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是指动、植物体内一系列分子量为26～34kD、选择性强、能高效转运水分子的膜蛋白，其种类繁多、分布广泛，是植物体内水分平衡调节的分子基础[4]。AQPs作为生物体中广泛存在的功能性跨膜蛋白，是水分跨膜运输的主要途径，在介导不同类型细胞的水分运输、维持水分平衡和干旱胁迫下细胞内的渗透调控以及提高植物抗旱性中发挥重要作用[5-9]。

质膜内在水通道蛋白（plasma membrane instrinsic proteins，PIPs）能够介导叶和根中水分的跨膜运输传导[10]。Vandeleur[11]等发现冬葡萄×沙地葡萄的杂交种‘R-110’中的PIP1；1在其根中的表达量最多，PIP1；2、PIP2；2 在其叶中有最高表达量；Perrone[12]等研究发现PIP2；4在欧亚葡萄‘歌海娜’的根中有特异性表达；颜培玲[9]等从中国野生毛葡萄（V.heyneana）‘花溪-9’中克隆出9个PIP基因，其中得到的VhPIP1基因在其根中有最多表达量。由此可知，PIPs蛋白参与水分的吸收和运输，在根中的高度表达，为参与根系的导水率，增加水通道蛋白的活性，以及促进根系吸收土壤中的水分和水分的径向运输提供更重要的作用[13]。同时，PIPs蛋白还参与叶片气孔的运动、蒸腾作用以及光合作用的顺利进行，因此有的PIPs基因会在叶片中高效表达[14-15]。

在干旱中度胁迫初期，在‘R-110’中的PIP1；1、PIP1；2、PIP1；3、PIP2；1 和 PIP2；2 在根与叶中的表达量的比值会上升，在持续胁迫7d后，根与叶中表达量的比值恢复至对照水平[16]；欧亚酿酒品种‘歌海娜’和‘霞多丽’经干旱处理8～10d后，VvPIP2；2 表达量不变[17]；Pou[18]等以欧亚酿酒品种‘霞多丽’为材料，发现在水分胁迫下，PIP2；1、PIP2；2表达下调；Chitarra[19]等干旱胁迫处理2a生葡萄‘歌海娜’植株，发现葡萄叶片中的PIP2；4表达量下调，并且还发现PIPs基因参与木质部栓塞的形成；而抗旱性强的毛葡萄‘花溪-9’VhPIP1的表达量随着胁迫时间的延长先增加后降低，而不抗旱的欧亚种‘红地球’VvPIP1的表达量呈下降的趋势，表明VhPIP1的表达丰度与毛葡萄抗旱性密切相关[9]。由此可知，PIPs基因参与葡萄干旱胁迫过程，但是其具体作用还要通过转基因等技术进行功能验证。

1.2.2 脱水响应基因

在干旱胁迫下，脱水响应基因RD系列基因诱导表达，引起植物的抗旱反应，RD系列主要有RD29A、RD29B、RD22等。葡萄的RD22基因是一个组成型表达基因，其表达量低，干旱诱导特性可被ABA调节。在干旱胁迫条件下，耐寒葡萄品种（V.vinifera‘Razegui’）和干旱敏感品种（V.Vinifera‘Syrah’）的VvRD22基因表达量均显著增加，因此，VvRD22基因的干旱诱导表达与品种无关[20]。

1.2.3 晚期胚胎发生丰富蛋白

LEA蛋白即高等植物胚胎发育晚期丰富蛋白（Late embryo genesis abundant proteins，LEA proteins），可以在细胞层面上保护植物体免受干旱胁迫的损伤，且LEA基因的表达或蛋白的积累与抗逆性存在正相关性。LEA蛋白作为脱水保护剂，或是一种调节蛋白参与植物渗透调节来提高植物抗旱性。同时，LEA蛋白可能还具有去垢剂和分子伴侣的特点，在水分胁迫下，能稳定和保护植物大分子的结构，对植物提高抗旱能力有着重要作用[21]。Yang等[22]从燕山葡萄株系‘燕山-1’中获得脱水素基因DHN1、DHN2、DHN3 和 DHN4。吴康[23]等以欧洲葡萄‘无核白’品种为材料，以‘霞多丽’品种脱水素基因序列设计引物得到这两个不同的脱水素基因DHN1-L和DHN1-S。这些基因的获得也为脱水素基因家族的进一步深入研究和有效利用提供依据和参考。

2 葡萄抗旱相关的调节基因

调节基因主要对信号传导和基因表达的过程进行调节。主要包括传递信号和调控基因表达的转录因子基因、感应和转导胁迫信号的蛋白激酶基因、在信号传导中起重要作用的蛋白酶基因。

2.1 葡萄抗旱相关转录因子

转录因子是转录起始过程中RNA聚合酶所需的辅助因子。在无转录因子时，真核生物的基因不表达，RNA聚合酶自身也无法启动基因的转录，只有当转录因子结合在特定的DNA序列上后，相关基因才能表达。植物体内干旱胁迫信号经过一系列信号传导，最终通过激活特定的转录因子与其相应的顺式作用元件相结合，在转录水平上调控一系列基因的表达，所以转化调节基因可以有效地提高植物的耐旱性。与抗旱相关的转录因子有MYC／MYB、AP2/ERF和MAPK等。

2.1.1 MYB/MYC转录因子

MYB/MYC是植物中最大一类转录因子家族之一，参与次生代谢、细胞形态发生、生物和非生物胁迫应答等过程。J.T.macus[24]等发现葡萄第一个bHLH基因MYCA1。MYCA1在葡萄幼苗受到非生物胁迫时也能做出反应。

2.1.2 AP2/ERF类转录因子

AP2/ERF类转录因子参与植物对高盐、干旱等环境胁迫的响应，ERF类转录因子（Ethylene-Responsive element binding Factor）是一类能结合乙烯应答元件的蛋白，而干旱、低温、盐碱等逆境胁迫都能诱导ERF亚家族基因的产生，提高植物的相关抗性[25]。ERF转录因子调控胁迫相关功能基因的表达，在植物应对生物及非生物胁迫反应、提高植物的抗逆性中均起着重要的作用。王文艳等[26]以‘藤稔’葡萄的叶片为试材，克隆了水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）信号转导途径中的重要基因 NPR1、PR1、COI1和 LOX2，利用定量和半定量PCR法研究其在SA与JA处理后的表达情况。干旱、低温、盐碱等逆境胁迫的诱导下这些基因的过量表达表明了ERF亚家族基因与提高植物的抗性有关。

2.1.3 MBF1转录因子

多蛋白桥梁因子MBF1（Multiprotein bridging factor 1）在真核生物中是一个高度保守的转录辅激活因子，它主要是通过连接特异转录因子和TATA-box结合蛋白（TBP）来促进靶基因的转录。已有研究表明，植物MBF1参与植物的生长发育和多种胁迫反应，超表达MBF1可以提高植物对多种胁迫的抵抗力[27-28]。Yan[29]等首次从葡萄中分离干旱胁迫响应基因VvMBF1，并通过在模式植物拟南芥中超表达VvMBF1基因研究其抗旱能力，结果表明：VvMBF1转基因株系叶片气孔比野生型植株对ABA敏感；VvMBF1转基因株系中依赖于ABA途径的抗旱基因AtRD22和AtRD29B的表达量显著高于野生对照。

2.2 感应和转导胁迫信号的蛋白激酶基因

促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）基因是感应和转导胁迫信号相关的蛋白激酶基因，MAPK家族成员是细胞信号转导中极为重要的一类蛋白激酶，它参与多种信号传递过程，通过对转录因子的磷酸化，调控多种基因的表达；MAPK级联信号传递途径在介导生长因子、激素反应、细胞增殖和分化、胞外环境胁迫信号和调节胞内胁迫反应中起重要作用。Samia Daldoul等[30]以葡萄为材料，以非生物胁迫诱导VvMAPK激酶基因的表达，克隆并获得其cDNA序列，该发现为今后研究葡萄的MAPK途径提供了基础。

3 问题和展望

近年来，随着分子遗传学、转录组学、蛋白质组学和基因表达调控的研究，葡萄抗旱分子机制的不断深入和转基因技术的日趋完善，利用现有的野生抗旱资源与现代生物技术相结合，在分子水平上培育高效抗旱葡萄新品种是今后葡萄育种的发展趋势。葡萄对干旱胁迫的响应受多基因调控，很难从单个或几个基因的作用解释葡萄抗旱的分子机理，应该全面系统的研究多基因的协同作用。所以，要大幅度提高葡萄的抗旱性，培育优良抗性新品种只能在充分了解葡萄干旱胁迫下的生理生化反应及分子机制的基础上，采用多功能基因、主效基因和调节基因结合转化的策略，才有可能在整体水平上提高葡萄的抗旱能力。国内研究主要集中在对已有葡萄品种和砧木抗旱性的比较与鉴定上，缺乏对葡萄抗旱性的深入研究和利用，尤其是对喀斯特地貌等特殊地形地貌条件下的抗旱野生葡萄品种的抗旱分子机制研究较少。因此，结合蛋白质组学、功能基因组学、蛋白质组学及转录组学的技术与方法，例如突变体库的筛选、微阵列分析、定量蛋白质组学分析，大规模鉴定葡萄的抗旱基因，从而全面揭示葡萄抗旱分子机制、筛选抗旱砧木，综合改良培育抗旱性较强的葡萄新品种。

［1］Liu C C，Liu Y G，Guo K，Fan D Y，et al.Effect of drought on pigments，osmotic adjustment and antioxidant enzymes in six woody plant species in karst habitats of southwestern China［J］.Environ.Exp.Bot，2011，71：174-183.

［2］黄志，邹志荣，黄焕焕，等.甜瓜抗旱性相关基因MeP5CS的克隆、序列分析及表达［J］. 园艺学报.2010，37（8）：1279-1286.

［3］Liu J H，Nakajima I，Morriguchi T .Effects of salt and osmotic stresses on free polyamine content and expression of polyamine biosynthetic genes in Vitis vinifera［J］.Biologia Plantarum，2011，55（2）：340-344

［4］Sengupta S，Majumder AL.Physiological and genomic basis of mechanical-functional trade-off in plant vasculature［J］.Plant Sci.，2014，5（224）：1-18.

［5］Maurel C，Verdoucq L，Luu D T，et al.Plant aquaporins：Membrane channels with multiple integrated functions［J］.Annual Review of Plant Biology，2008，59：595-624.

［6］Tomoaki H，Toshiyuki K，Genki S，et al.Mechanisms of water transport mediated by PIP aquaporins and their regulation via phos phory lation eventsundersalinity stress in barley roots［J］.Plant Cell Physiology，2011，52（4）：663-675.

［7］Ricardo A，Rosa P，Juan M R.Regulation of root water uptake under abiotic stress conditions［J］.Journal of Experimental Botany，2012，63（1）：43-57.

［8］张燕，李娟，姚青，等.枇杷质膜水孔蛋白基因EjPIP1的克隆及AM真菌对其表达的影响［J］.中国农业科学，2014，47（7）：1387-1396.

［9］颜培玲，潘学军，张文娥.野生毛葡萄水通道蛋白基因VhPIP1的克隆及其在干旱胁迫下的表达分析［J］.园艺学报，2015，42（2）：221-232.

［10］Heinen R B，Ye Q，Chaumont F.Role of aquaporins in leaf physiology［J］.Journal of Experimental Botany，2009，60（11）：2971-2985.

［11］Vandeleur R K，Mayo G，Shelden M C，gilliham M，et al.The role of plasma membrane intrinsic protein aquaporins in water transport through roots：diurnal and drought stress responses reveal different strategies between isohydric and anisohydric cultivars of grapevine［J］.Plant Physiol，2009，149：445-460.

［12］Perrone I，gambino g，chitarra W，Pagliarani C，Riccomagno N，Balestrini R，Kaldenhoff R，Uehlein N，gribau do I.The grapevine root-specific aquaporin VvPIP2；4 N controls root hydraulic conductance and leaf gas exchange upon irrigation but not under water stress［J］.Plant Physiol，2012，160：965-977.

［13］Sakurai-Ishikawa J，Murai-Hatano M，Hayashi H，et al.Transpiration from shoots triggers diurnal changes in root aquaporin expression ［J］.Plant，cell environ，2011，34：1150-1163.

［14］Flexas J，Bota J，Escalona J M，etal.Effects of drought on photosynthesis in grapevines under field conditions：an evaluation of stoma tal and mesophyll limitations［J］.Funct.Plant Biol.，2002，29：461-471.

［15］Ferrio J P，Pou A，Florez-Sarasa I，et al.The Peclet effect on leaf water enrichment correlates with leaf hydraulic conductance and mesophyll conductance for CO2［J］.Plant Cell Environ，2012，35：611-625.

［16］Galmés J，Pou A，Alsina MM，et al.Aquaporin expression in response to different water stress intensities and recovery in Richter-110（Vitis sp.）：relationship with ecophysiological status ［J］. Planta，2007，226：671-681.

［17］Vandeleur R K，Mayo G，Shelden M C，et al.The role of plasma membrane intrinsic protein aquaporins in water transport through roots：diurnal and drought stress responses reveal different strategiesbetween isohydric and anisohydric cultivars of grapevine［J］.Plant Physiol，2009，149：445-460.

［18］Pou A，Medrano H，Flexas J，et al.A putative role for TIP and PIP aquaporins in dynamics of leaf hydraulic and stomatal conductances in grapevine under water stress and re-watering［J］.Plant，Cell and Environment，2013，36：828-843.

［19］Chitarra W，Vitali M，Pagliarani C，et al.Gene expression in vessel associated cells upon xylem embolism repair in Vitis vinifera L.petioles［J］.Planta 2014，239：887-899.

［20］HananaM，DelucL，FouquetR.Identification and characterization of "rd22" dehydration responsive gene in grapevine （Vitis vinifera L.）［J］.Comptes Rendus Biologics ，2008，331（8） ：569-578.

［21］Qiu Q S，Wang Z Z.Changes of UHN1 expression and subcelluar distributeon in A.delicisoa cells under osmotic stress ［J］.Science in China，2002，45（1）：1-1.

［22］Yang Y，He M，Zhu Z，et al.Identification of the dehydrin gene family from grapevine speciesand analysis of their responsiveness to various forms of abiotic and biotic stress ［J］.BMC Plant Biology，2012，12：140.

［23］吴康，杨亚洲，张朝红，等.无核白葡萄脱水素等位基因的克隆和序列分析 ［J］. 果树学报，2012，29（2）：177-183.

［24］J.T.Matus，M.J.Poupin，P.Canon.Isolation of and bHLH genes related to flavonoid synthesisin grapevine （Vitis vinifera L.）［J］.Plant Mol Biol，2010，72：607-620.

［25］Singh K，Foley R C，Onate-Sanchez L.Transcription factorsin plantdefense and stressresponses［J］.Curr Opin Plant Biol，2000，5（5）：430-436.

［26］王文艳，岳林许，张演义，等贵.葡萄SA和JA信号转导重要基因克隆及其对外源信号应答?分析［J］.园艺学报，2012，39（5）：817-827.

［27］ArceDP，Tonón C，ZanettiME，etal.The potato transcriptional co-activator StMBF1 is up-regulated in response to oxidative stress and interacts with the TATA-box binding protein.J Biochem Mol Biol，2006，39：355-360.

［28］Mauro MF，Iglesias MJ，Arce DP，et al.MBF1s regulate ABA-dependentgermination of Arabidopsis seeds.Plant SignalBehav，2012，（7）：188-192.

［29］Yan Qin，Hou Hongmin，Singer Stacy D，et al.The grape VvMBF1 gene improves drought stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana［J］.Plant Cell，Tissue&Organ Culture，2014，（5）.

［30］Samia D，Michael H，Ahmed Mliki.OsmoticStress Induces the Expression of VvMAP Kinase Gene in Grapevine （Vitis vinifera L.）［J］.Journal of Botany，2012.