假烟叶树叶多酚物质的提取工艺优化

陈 蓓，姚 慧，林海燕，陆 英,，谭 斌

（1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128）

假烟叶树叶多酚物质的提取工艺优化

陈 蓓1，姚 慧1，林海燕2，陆 英1,2，谭 斌2

（1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128）

通过单因素试验和正交试验设计对假烟叶树叶中的多酚物质提取工艺进行了优化。结果表明，各因素对假烟叶树叶中多酚物质提取效果的影响从大到小排列依次为：乙醇浓度＞固液比＞提取时间＞提取温度；最佳提取工艺为：乙醇浓度40%、提取温度90℃、固液比1∶30、提取时间1.0 h，连续提取2次；该条件下多酚物质的提取率为5.33%，提取物中多酚含量为24.98%，回收率达98.4%。

假烟叶树；多酚；乙醇；提取工艺；优化

假烟叶树（Solanum verbascifolium L.），又名野烟叶、土烟叶、山烟、野茄树，属茄科茄属植物。生于海拔300～2 100 m的向阳路边、荒地，分布于福建、台湾、广东、海南、广西、四川、贵州和云南等地；其根、叶、果均可入药，具小毒，有解毒消肿、除风止痛、凉血止血的功效[1-4]。Adam等[5]的研究表明，假烟叶树中含有澳洲茄碱、澳洲茄边碱、薯蓣皂苷元等生物活性成分。目前，对假烟叶树的商业化开发利用较少，基于民间对假烟叶树的使用多为水提取物，而上述文献中的化学物质多为亲脂性成分，它们在水中溶解度很小。因此，有必要对假烟叶树中的亲水性成分做进一步研究，以期明确其中的活性成分，为假烟叶树的开发应用提供依据。

前期的研究发现，假烟叶树叶中含有多种多酚类化合物，鉴于天然多酚类化合物具有的抗氧化作用以及强化血管壁、促进肠胃消化、降血压降血脂、预防动脉硬化和血栓形成、增强人体免疫力、抑制细菌和癌细胞生长等多种功效[6-9]，笔者对假烟叶树叶中的多酚物质进行了提取，并对提取工艺进行了优化，获得活性成分含量较高的提取物，为假烟叶树多酚物质的后期开发利用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试假烟叶树叶于7月采自广东省假烟叶树种植基地，为当年新生茎叶，60℃恒温干燥后粉碎备用。

供试试剂有色谱甲醇（国药集团化学试剂公司），Folin-C试剂、没食子酸标准品（成都曼思特生物技术有限公司，纯度97%），95%食用乙醇（市购）。

主要仪器设备有LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）、WondasilTM Cl8色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、UV-2600 紫外可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）、RE-52AA 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、HH数显恒温水浴锅（金坛市金城国胜实验仪器厂）、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科技工贸有限公司）、DHG-9146A型电热鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 假烟叶树叶乙醇提取物的HPLC检测 取假烟叶树叶原料用10倍甲醇60℃回流提取1 h，提取液进行HPLC分析。色谱条件为：甲醇（B相），水（A相），梯度洗脱：0 min（B：5%，A：95%）→30 min（B：30%，A：70%），输出波长320 nm，流速1 mL/min，柱温30℃。

1.2.2 假烟叶树乙醇提取物中多酚含量的检测方法

（1）标准曲线的绘制。精确称取104 mg没食子酸于100 mL容量瓶中，经水超声溶解，冷却定容得母液1.0088 mg/mL，分别取母液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 mL于100 mL容量瓶中，加50 mL水，再加5 mL Folin-C试剂，摇匀后再加入15 mL 20%Na2CO3溶液，用水定容至刻度，于30℃反应2 h后以空白样品调零，在765 nm波长下测定标准溶液的吸光度，以没食子酸质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。（2）样品含量的检测。精确称取0.5 g假烟叶树样品，加入100 mL 60%乙醇，80℃回流提取2 h，过滤，滤液定容至250 mL，吸取0.5 mL溶液，于100 mL容量瓶中，其他操作与标准品相同，于765 nm处测定吸光值，根据标准曲线计算假烟叶树中多酚含量。

1.2.3 单因素试验设计 准确称取0.5 g假烟叶树粉末若干份，分别对乙醇浓度（0%、20%、40%、60%、80%）、固液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、提取温度（60、70、80、90、100℃）、提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）进行单因素试验，以多酚提取量为指标，考察4个因素对提取效果的影响。

1.2.4 正交试验设计 针对乙醇浓度（A）、提取温度（B）、固液比（C）、提取时间（D）4个因素，以单因素试验确定的较佳条件为中心选择3个水平，进行L9（34）正交试验（见表1），对结果进行方差分析，确定各因素对假烟叶树叶多酚物质提取效果的影响，得到最佳提取工艺参数。

1.2.5 提取次数的确定 精确称取0.5 g假烟叶树叶粉末4份，按正交试验确定的最佳提取工艺分别提取1次、2次、3次、4次，滤液定容至100 mL， 吸取1 mL样液，测定吸光值，根据标准曲线计算多酚提取量，并以提取率为指标确定提取次数。

1.2.6 最佳提取工艺验证 根据上述确定的假烟叶树中多酚最佳提取方法，取5 g原料进行提取，平行制备两次，测定产品得率、多酚含量及回收率。

2 结果与分析

2.1 假烟叶树叶乙醇提取物的HPLC图谱分析

假烟叶树叶60%乙醇提取液的HPLC图谱见图1，PDA紫外扫描显示色谱图中保留时间在8～20 min内的7个主要组分均具有相似的紫外吸收光谱（见图2），在320和220 nm 左右有较大吸收，具有明显的酚酸类化合物的紫外吸收特征。

2.2 假烟叶树叶乙醇提取物中多酚物质含量的测定

以没食子酸的吸光值（A）为纵坐标，没食子酸质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，见图3，得线性回归方程为y=17.058 x-0.065（R2= 0.999 2），可见没食子酸质量与吸光度有良好的线性关系。按1.2.1中的方法提取，测得假烟叶树叶中多酚含量为13.53 mg/g。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 乙醇浓度对假烟叶树叶中多酚物质提取的影响

由图4可知，在0～60%的浓度范围内，随着乙醇浓度的增加，假烟叶树叶中多酚物质的提取量缓慢增加；其中，在40%与60%的乙醇浓度下，多酚物质的提取量相当；而当乙醇浓度大于60%时，多酚物质的提取量反而下降。因此，综合考虑后确定乙醇浓度为40%。

2.3.2 固液比对假烟叶树叶中多酚物质提取的影响

由图5可知，多酚物质的提取量随固液比的增大而缓慢增加。但是，提取时溶剂用量越大，后续工作量也随之增加。因此，选择1∶20的固液比较为合适。

2.3.3 提取温度对假烟叶树叶中多酚物质提取的影响

由图6可知，随着提取温度的升高，假烟叶树中的多酚提取量缓慢增大；当提取温度达80℃时，总多酚物质的提取量最高；而当温度继续上升时，提取量反而下降。因此，宜选择80℃为提取温度。

2.3.4 提取时间对假烟叶树叶中多酚物质提取的影响

由图7可知，假烟叶中的多酚提取量随着提取时间的延长而缓慢增大，不同提取时间之间的多酚物质提取量差异不大。因此，考虑到生产效率、生产成本等因素，研究确定假烟叶树中多酚物质的提取时间为1 h。

2.4 正交试验结果

从表2中的极差项可以看出，各因素对假烟叶树叶中多酚物质提取效果的影响从大到小排列依次为：乙醇浓度＞固液比＞提取时间＞提取温度；由均值可以看出，假烟叶中多酚物质的最佳提取工艺为即乙醇浓度40%，提取温度90℃，固液比1∶30，提取时间1.0 h。

2.5 提取次数对假烟叶树叶中多酚物质提取效果的影响

从表3中可以看出，增加提取次数，假烟叶树中多酚类物质的提取量有所提高，提取2～4次，多酚类物质的提取量比仅提取1次的高1.36～1.43 mg/g，其提取率也比仅提取1次的高10.02～10.58个百分点；但是，提取2次、3次或4次，之间的差异不明显，且多酚类物质的提取量及得率均以提取2次的最高。因此，确定假烟叶树叶中多酚物质的提取次数以2次为宜。

2.6 最佳提取工艺的验证

以正交试验确定的最佳工艺条件对5 g假烟叶树叶中多酚物质连续提取2次，提取液经浓缩干燥获得假烟叶多酚干粉，两次制备平均得0.266 7 g，提取率为5.33%，提取物中多酚含量为24.98%，回收率达98.4%。这表明该提取工艺稳定、可靠，回收率高。

3 结 论

通过高效液相色谱分析发现，假烟叶树叶的乙醇提物具有多酚类化合物的光谱特征，因此研究通过单因素试验和正交试验设计优化了假烟叶树叶多酚物质的提取工艺，为假烟叶树多酚物质的工业化生产提供了基础。研究结果表明，在乙醇浓度40%、提取温度90℃、固液比1∶30、提取时间1.0 h的条件下连续提取2次，多酚物质的提取率为5.33%，提取物中多酚含量为24.98%，回收率达98.4%。

假烟叶树在我国分布广泛，尤其在华南地区生长旺盛，野生资源较丰富。目前，关于该植物的开发利用报道较少，随着人们对植物多酚物质生物活性（例如护肝益肾、抗动脉硬化、防治冠心病等心血管疾病）的关注，假烟叶树的开发前景广阔。该研究结果为假烟叶树多酚物质的后期开发利用奠定了基础，同时对促进我国民族药用植物资源开发利用也有重要意义。

[1] 陈封怀. 广东植物志第二卷[M]. 广州：广东科学技术出版社，1991.

[2] 江苏新医学院. 中药大辞典（下册）[M]. 上海：上海科学技术出版社，1977.

[3] 吴修仁. 广东药用植物简码[M]. 广州：广东高等教育出版社，1989.

[4] 南京药学院《中草药学》编写组. 中草药学（下册）[M]. 南京：江苏科学技术出版社，1980.

[5] Adam G，Huong H T，Knoi N H. Solaverbascine - a new 22，26-epiminocholestane alkaloid from Solanum verbascifolium[J]. Phytochemistry，1980，19（5）：1002-1003.

[6] 左丽丽，王振宇. 植物多酚类物质及其功能研究进展[J]. 中国林副特产，2012，（5）：39-43.

[7] 左 玉. 多酚类化合物研究进展[J]. 粮食与油脂，2013，26（4）：6-7.

[8] 陈曾三. 植物多酚功能性及其开发利用[J]. 粮食与油脂，2000，（3）：40-41.

[9] 宋立江，狄 莹. 植物多酚研究与利用的意义及发展趋势[J]. 化学进展，2000，12（2）：161-170.

（责任编辑：成 平）

Process Optimization of Polyphenols Extraction from Solanum verbascifolium L. Leaves

CHEN Bei1，YAO Hui1，LIN Hai-yan2， LU Ying1,2，TAN Bin2

（1.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University , Changsha 410128, PRC; 2.National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, PRC）

This study investigated optimal conditions of extracting polyphenols from Solanum verbascifolium L.leaves with single factor and orthogonal experiment designs. The results showed that the effect of polyphenols extraction from Solanum verbascifolium L. leaves was infuenced by such factors in the decreasing-degree order as concentration of ethanol＞ the ratio of raw materials to solvent ＞ extraction time＞ extraction temperature. The optimum extraction conditions included the ethanol concentration at 40%, temperature at 80℃, ratio of solid to liquid at1:20, and extraction for1.5h and 2 times, under which the yield of polyphenols could reach as high as 5.33%, the content of the extract was 24.98% and the recovery rate of polyphenols was 98.4%.

Solanum verbascifolium L.; polyphenol; ethanol; extraction process; optimization

Q946.82

A

1006-060X（2015）08-0083-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.08.026

2015-07-17

湖南农业大学大学生科技创新项目（2015年）

陈 蓓（1995-），女，湖南郴州市人，本科，专业为植物资源工程。

谭 斌