湖南省柑橘黄龙病菌M94319和16SrRNA序列的扩增和分析

董 俊，戴良英，易图永

（1. 湖南农业大学植物保护学院，长沙 410128；2. 植物疾病控制与利用湖南省高校重点实验室，长沙 410128；3. 植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，长沙 410128）

湖南省柑橘黄龙病菌M94319和16SrRNA序列的扩增和分析

董 俊1,2,3，戴良英1,2,3，易图永1,2,3

（1. 湖南农业大学植物保护学院，长沙 410128；2. 植物疾病控制与利用湖南省高校重点实验室，长沙 410128；3. 植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，长沙 410128）

为了研究柑橘黄龙病菌是否存在遗传分化现象，对采自湖南、江西、福建等3个省的20多个县（市）的柑橘黄龙病样品，提取了总DNA，并对16S rDNA和M94319基因序列进行了PCR扩增、测序，通过MEGA5.0生物信息学软件对这些序列进行了分析。结果表明，在柑橘溃疡病遗传多样性分析过程中M94319基因序列的分辨率比16S rRNA高，即M94319基因序列基因片段能有效地检测出黄龙亚洲种，16S rRNA区分不了各个小种。

柑橘黄龙病；遗传多样性；16S rDNA；M94319

柑橘黄龙病在柑橘生产中是最难防治、危害巨大的一种毁灭性病害[1]，至今没有能完全治愈发病植株的特效药[2]，被称做柑橘的癌症。目前，柑橘黄龙病已成为柑橘产业的最大障碍，它不仅危害着广大柑橘种植者的利益，也严重威胁着柑橘产业的发展[3]。随着柑橘种植技术的大力推广和政府的扶持，以及全球气候变暖，柑橘黄龙病的发生区域仍在逐年增多[4]。

16S rDNA在细菌分类中应用非常广泛，其高度的保守性和稳定性使之成为了分子生物学研究的一个热点[5]。根据该序列片段设计OI1/OI2引物来进行黄龙病的检测[6]。但随着近年来不断的深入研究发现了16S rDNA在分类上的一些缺点，其数据库还不完整，在分析亲缘关系较近的小种时难以达到要求[7]。M94319基因序列是黄龙病致病菌一段保守性较好，长度适中的基因片段。暂时关于该片段的报道与记载还不多，但该序列是柑橘黄龙病亚洲种病原菌特有的基因片段，根据其序列设计的TL/TR引物对湖南及其周边地区的黄龙病检测效果非常好，其对于黄龙病研究的作用与意义还有待进一步的开发[8-9]。为了解柑橘黄龙病在湖南省的分布情况、传播特点、种群差异及建立柑橘黄龙病综合防治示范区[10]，对湖南省的零陵区、江华县、江永县、道县、宜章县、资兴市等20多个县（市），以及江西省的大余县、信丰县，福建省泉州市的疑似样品进行检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采用北京全式金生物技术有限公司的植物DNA提取试剂盒（EasyPuer®Plant Genomic DNA Kit）提取柑橘叶片总DNA，将提取的DNA保存在冰箱-20℃保存，并选取用检测柑橘黄龙病菌的特异引物PCR扩增测序后呈阳性的DNA抽提液（DX01、DX12、JY09、LL16、JH07、LW14、YZ05、BH02、ZX18、RC17、YX07、XF04、XF06、DY02、DY05、FJ02、FJ03），用以扩增16S rDNA。样品来自湖南、江西、福建3个省的22个县（市）及地区，基本涵盖了湖南省柑橘黄龙病的主要发病地区，还有同地区不同寄主的的带病样品，可以大致反映湖南地区柑橘黄龙病的分化情况及其与周边省份的遗传距离。

1.2 引物的选择

通过不同退火温度梯度的设置和其他PCR扩增的条件探索中发现OI1/OI2与TL/TR引物能够共用同一套PCR反应体系与参数，具体反应体系和反应参数如下：

PCR反应体系（50 μL）：模板DNA2.5μL，Forward Primer1.0μL，Reward Primer 1.0μL，10×PCR Buffer4.0μL，dNTPs3.0μL，Tap DNA聚合酶0.5μL，双蒸H2O 38μL；PCR反应参数：裂解94℃ 5 min，变性94℃40 s，退火56℃40 s，延伸72℃ 1 min，35个循环，延伸72℃ 7 min，保存4℃。

PCR扩增结果与阳性对照保持一致的样品送至上海生工或长沙铂尚测序，同种引物的测序结果用系统发生软件MEGA5.0进行聚类分析，构建系统发育树进行分析。

2 结果与分析

2.1 发病区域

通过各个地区样品的PCR扩增检测及测序结果显示以下地区的样品中有感染了柑橘黄龙病的阳性植株，整理结果如表1所示。

2.2 16S rDNA引物扩增结果

采用16S rDNA序列引物OI1/OI2对表4中的17个阳性样品进行PCR扩增，扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示。

图1中的1～17号分别对应检测编号的DX01、DX12、JY09、LL16、JH07、LW14、YZ05、BH02、ZX18、RC17、YX07、XF04、XF06、DY02、DY05、FJ02和FJ03，测序结果用系统发生软件MEGA5.0进行聚类分析，分析结果见图2。

从图2中可以看出，16S rDNA序列引物可以将3个省的17个样品大致分为5簇，DX12、JY09、LL16、LW14、BH02、DX01和JH07为 第 一 簇；YZ05、ZX18、RC17、YX07和XF06为 第 二 簇；DY02为第三簇；DY05、XF04为第四簇；FJ02和FJ03为第五簇。第一簇包括永州市的5个样品及郴州临武县、北湖区的样品，位置主要是湖南省的西南部；第二簇包括郴州4个样品及信丰县（赣南脐橙），位置在湖南省东南部及江西省西南部；大余县的温州蜜桔单独为第三簇；第四簇包括大余县（椪柑）和信丰县（砂糖柑）两个样品；第五簇则为福建的两个样品。

2.3 M94319序列引物扩增结果

采用M94319序列引物TL/TR对17个阳性样品进行PCR扩增，扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图3所示：

图3中的1～17号分别对应样品的DX01、DX12、JY09、LL16、JH07、LW14、YZ05、BH02、ZX18、RC17、YX07、XF04、XF06、DY02、DY05、FJ02、FJ03，测序结果用系统发生软件MEGA5.0进行聚类分析。

从图4可以看出，M94319序列引物TL/TR将湖南、江西、福建的17个阳性样品分为5簇，LL16、DX12、LW14、JH07、BH02和JY09为一簇；YX05、DX01、ZX05、YX07、XF06和RC17为第二簇；DY02和XF04分别为单独的一簇（第三、四簇）；DY05、FJ02、FJ03为第五簇。第一簇主要是湖南西南部地区，包括了零陵区、道县（琯溪蜜柚）、临武县、江华县、北湖区的样品；第二簇主要是湖南省东南部，包括了宜章、道县（脐橙）、资兴市、永兴县、汝城县及江西信丰县（赣南脐橙）；江西省大余县（温州蜜桔）和信丰县（砂糖柑）分别为单独的一簇，第五簇包括了江西省大余县（椪柑）及福建省的两个样品。

3 小 结

从20世纪80年代开始至今，黄龙病在整个湖南省的发病范围逐步扩大，柑橘木虱的生活地区也在逐年增多，发病地已从少数零星地区蔓延到了湖南省的几乎整个南部和西南大部分地区，造成了巨大的经济损失，严重制约了柑橘产业的发展[11]。使用16S rDNA及M94319序列设计的引物对湖南、江西、福建的样品进行检测并分析其遗传多样性[12]，并在发病严重的零陵区建立综合防治示范区进行综合防控的研究。所得到的数据基本可以反映出湖南省黄龙病病菌之间及其与江西、福建两省的遗传分化距离，大量综合防控的工作，这些都对该病害的鉴定及综合治理具有一定的指导意义。

两种引物对湖南、江西、福建这三个省的17个阳性样品的DNA进行PCR扩增后用系统发生软件MEGA5.0进行聚类分析[13]，16S rDNA扩增的目标片段约为1160 bp，M94319引物扩增目标片段约为560 bp。两图均表明样品来源的地域差异是造成分化的主要原因，寄主作物品种的差别也是造成遗传分化的重要因素之一，湖南省内的柑橘黄龙病病原菌的遗传分化较小，江西赣州市与湖南地区的亲缘关系也较近，福建地区黄龙病病原菌和湖南地区的遗传差距最大。

16S rDNA和M94319基因序列构建的柑橘黄龙病系统发生树可以看出两者的相同性较高， 17个黄龙病阳性样品分为五簇，但是16S rDNA的引物OI1/OI2只能鉴定出柑橘黄龙病的病原菌，鉴定病原菌的小种时该序列不能直观反映出其差异性[14]。M94319基因是柑橘黄龙病亚洲种的片段，其引物TL/TR能够很好的分析出病原菌的小种，对湖南省的病原菌种类分析要好于16S rDNA的引物OI1/OI2。

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（责任编辑：石 君）

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（责任编辑：石 君）

Amplification and Analysis of M94319 and 16SrDNA Sequence of Citrus Huanglongbing in Hunan

DONG Jun1,2,3，DAI Liang-ying1,2,3，YI Tu-yong1,2,3

（1. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. Hunan Colleges Key Laboratory of Control and Utilization of Plant Disease, Changsha, 410128, PRC; 3. Hunan Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Pests, Changsha 410128, PRC）

In order to study whether citrus Huanglongbing pathogen has the phenomenon of genetic differentiation, samples with citrus Huanglongbing were collected from more than 20 counties (cities) in Hunan, Jiangxi and Fujian, the total DNA was extracted, 16S rDNA and M94319 gene sequence were amplifed by PCR and sequenced, and the sequencing results were analyzed with the bioinformatics software MEGA5.0. The results showed that M94319 gene sequence had higher resolution than 16S rDNA in the analysis of genetic diversity, which indicated that the fragment of M94319 gene sequence could effectively detect Huanglong Asian species, and 16S rDNA could not distinguish races.

citrus Huanglongbing; genetic diversity; 16S rDNA; M94319

S436.66

A

1006-060X（2015）08-0001-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.08.001

2015-06-20

农业部公益行业计划（201003067）

董 俊（1989-），男，湖南常德市人，硕士研究生，研究方向为植物病理。

易图永