抗菌脂肽Surfactin的抗菌活性及应用

翟少伟 李 剑 史庆超

(集美大学水产学院，鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，厦门 361021)

抗生素的发现为预防病菌感染、治疗动物疾病、促进养殖业的快速发展做出了巨大贡献。但滥用抗生素导致越来越多的耐药菌株的出现和药物残留等问题日趋严重，对人类和动物的健康构成了严重威胁［1］。寻找安全环保、无耐药性、无残留的抗生素替代品亟待解决。研究发现，由昆虫、动植物或微生物等基因编码合成以及人工合成的抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)具有广谱抗菌活性，不易产生耐药性，是潜在的抗生素理想替代品之一［2-3］。但从昆虫和动植物中提取 AMPs工艺复杂、含量极低使AMPs应用受到了极大的限制。研究者尝试通过基因重组表达等方法提高AMPs产量，但由于AMPs易受蛋白酶的攻击，且表达产物往往对宿主细胞有毒性而进展缓慢;此外，人工合成或者重组表达生产的AMPs在应用中可能存在安全问题不容忽视［4］。微生物代谢产生的AMPs，如芽孢杆菌脂肽、乳球菌肽、杆菌肽和细菌素等与昆虫和动植物源AMPs相比，具有高效抗菌优势［5］，成为近年研究热点。Surfactin是芽孢杆菌属不同菌株代谢产生的一种脂肽，是研究较为深入的微生物源AMPs之一［6］。研究表明，Surfactin具有广谱高效的抗菌活性，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌等多种细菌或真菌具有抗菌作用，而且对病毒、支原体和原虫等也具有显著的抑制效果［7］。作为一种优良的新型抗菌物质，Surfactin在医药、动物养殖、农业生防和食品保鲜等领域具有广阔的应用前景。

1 Surfactin的结构和理化性质

Surfactin最早由Arima等［8］于1968年在枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)IFO 3039发酵液中发现。Kakinuma等［9］之后对Surfactin的分子结构进行了报道，阐明了Surfactin由1个手性序列为LLDLLDL的七肽和1个含13到15个碳原子的β-羟基脂肪酸构成。Surfactin长脂肪酸链及肽链上的L-亮氨酸2(L-Leu2)、D-亮氨酸3(D-Leu3)、L-缬氨酸4(L-Val4)、D-亮氨酸6(D-Leu6)、L-亮氨酸7(L-Leu7)构成其亲油基团，环链骨架与L-谷氨酸1(L-Glu1)和L-天冬氨酸5(L-Asp5)2个酸性氨基酸残基构成亲水基团［10］。Bonmatin等［11］运用高分辨核磁共振氢谱结合分子动力学技术确定了Surfactin的三维结构。Surfactin在水溶液中呈马鞍型，位于同侧的氨基酸残基L-Leu2和DLeu6彼此面对，2个酸性氨基酸L-Glu1和L-Asp5构成了一个较小的极性结构域，具有轻微的亲水能力。在另一侧，氨基酸残基D-Leu3、L-Val4和L-Leu7与脂肪酸链构成主要的疏水结构域［12］。

两亲性化学结构使Surfactin表现出良好的表面活性和稳定性，仅需0.005%或更低浓度的Surfactin即可将双蒸水的表面张力从72 mN/m降至27 mN/m，其效果甚至优于十二烷基硫酸钠［7］。Surfactin的临界胶束浓度约为1×10-5mol/L，远低于许多化学合成的表面活性剂［7］。枯草芽孢杆菌SCUT09发酵产物中提取的脂肽Surfactin耐盐度高达21%，121℃高温处理2 h后的表面活性和乳化能力仍保持稳定［13］。Hwang 等［14］和孙力军等［15］对 Surfacrin的生理毒性研究显示，Surfactin小鼠口服半致死剂量(LD50)分别超过2 500和5 000 mg/kg，急性毒性属实际低毒或无毒级，表明Surfactin具有较高的安全性。其在畜禽及水产动物饲料中的安全剂量尚未见报道，还有待于进一步研究。

2 Surfactin的抗菌活性

研究表明，Surfactin对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌以及微浆菌等均具有较强的抑制作用。Gomaa［16］研究发现，从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)M104中分离出的Surfactin对蜡样芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及李斯特菌(Listeria monocytogenes)等革兰氏阳性菌和大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、伤寒性沙门氏菌(Salmonella typhimurium)以及变形杆菌(Proteus vulgaris)等革兰氏阴性菌和酵母菌(Candida albicans)均具有明显的抑菌作用。此外，Surfactin对哈威式弧菌(Vibro harveyi)、鳗弧菌(Vibro anguillarum)［17］、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)［18］、产气单胞菌(Aeromonas hydrophila)［19］和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)［20］等常见病原菌都具有温和的抑制效果。微浆菌能引起许多疾病，在后天免疫缺乏症候群疾病的过程中扮演着一个重要的角色。微浆菌没有细胞壁，其细胞膜主要由3层脂膜和固醇组成，在哺乳动物细胞培养过程中，细胞遭受到微浆菌感染的同时加入Surfactin，可使受感染的细胞恢复到未感染的细胞形态，并且不会对细胞产生毒性［21］。Hwang 等［22］报道，给感染细菌败血症的老鼠注射Surfactin，其血液中的细菌数量约为未注射的老鼠的1/400，表现出良好的抗菌效果。

近来研究发现，Surfactin还能有效对抗疱疹病毒(Herpes simplex virus)［23］、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)［24］、猪细小病毒(Porcine p arvovirus)、伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)［25］等多种病毒。此外，Surfactin对衣原体［26］、鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)［27］也具有显著的抑制作用。综上所述，Surfactin具有广谱高效的抗菌活性，作为抗菌药物研究与开发极具潜力。

3 Surfactin的抗菌机制

目前，Surfactin抗菌的具体机制尚不明确，普遍认为Surfactin的抗菌活性与其理化性质密切相关。很多学者试图通过提出不同假说，建立相关模型及开展试验来解释Surfactin的抗菌作用进程。鉴于Surfactin抗菌过程的复杂性，目前尚不明确其是通过哪一种途径或者多种途径共同作用而发挥抗菌效果。

3.1 攻击病原菌细胞膜，造成膜崩解或渗透压失衡

研究表明，Surfactin对病原菌作用的细胞靶位点是细胞膜［28］。目前，关于 Surfactin与微生物的细胞膜之间的作用机制主要有以下2种假说:1)去垢剂假说，Surfactin将带负电的肽环伸入水相，将其非极性的脂肪酸链插入到细胞膜磷脂分子层，达到一定浓度时，会产生类去垢剂的效应，使细胞膜产生裂缝并分离，胞内物质外泄，最终引起细胞生长受到抑制或死亡［29-30］。Deleu 等［31］以二油酰基磷脂酰胆碱(dioleoyl phosphatidylcholine，DOPC)作为流动相，二油酰基磷脂酰胆碱(dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC)作为凝胶相模拟细胞膜结构，研究Surfactin对膜脂质相分离作用表明，Surfactin的浓度起着至关重要的影响。当Surfactin的浓度低于临界微团浓度(CMC)时，Surfactin插入到膜的凝胶相和液体脂质结构域的边界处，这时Surfactin发挥类似胆固醇的作用，增强各相之间的范德华力，促进液相膜的流动。该阶段脂质体大小并没有受到影响，但膜内的降钙素会发生释放。随着Surfactin浓度的增加，接近至CMC时，DOPC立即发生溶解，由于Surfactin的选择作用，大部分DOPC分子被Surfactin溶解，并形成混合胶束，而DPPC的结构并不会受到影响。当浓度高于CMC后，Surfactin发挥其明显的增溶作用，DOPC和DPPC分子都被溶解形成混合胶束，使膜的大小的通透性发生变化。2)孔洞假说，该假说将Surfactin与生物膜作用简要分为3个过程［32-33］:1)Surfactin通过与膜之间的疏水作用力插入膜表面;2)由于Surfactin带负电荷的氨基酸和脂质头部产生电荷相互排斥，造成膜弯曲;3)膜体极不稳定而产生类似胶束的结构造成膜崩解。添加低浓度的Surfactin时其会和微浆菌的细胞膜结合，造成膜上孔洞的发生进而造成膜内外渗透压失衡使细菌死亡，而添加高浓度的Surfactin则会导致微浆菌整个细胞膜瓦解［34］。然而相同浓度的Surfactin并不会对哺乳动物细胞造成影响，其原因可能是微浆菌细胞膜上的胆固醇含量比哺乳动物细胞高20% ～30%，而且微浆菌细胞膜上磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺等磷脂质的比例也较高。高比例的胆固醇及磷脂质可能导致其对于Surfactin的感受性高于哺乳动物细胞，从而Surfactin能选择性的作用于微浆菌的细胞膜［35］。

3.2 抑制蛋白质合成，干扰病原菌繁殖

Brogden［36］和 Gueguen 等［37］认为脂肽可与病原菌染色体DNA发生相互作用，导致DNA的复制、转录、表达功能受抑制，影响细菌蛋白质的合成，进而导致病原菌繁殖受阻。但研究纳豆菌脂肽(活性成分为 Surfactin、Iturin和Fengycin)对金黄色葡萄球菌［38］和副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)［39］抑菌试验发现，抗菌脂肽虽然能与金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌的DNA体外结合，使DNA最大吸收峰发生了轻微的蓝移，并产生增色效应，但纳豆菌脂肽并不能抑制所有蛋白质的合成，而纳豆菌脂肽进入细胞后，能否到达细胞核和细菌染色体DNA发生作用，还需进一步研究。

3.3 抑制酶的活性，影响细胞正常代谢

Huang等［40］研究发现，枯草芽孢杆菌 fmbJ所产脂肽(活性成分Surfactin和Iturin)可抑制点青霉(Penicillium notatum)菌丝体细胞内琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)和苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase，MDH)活性，并且随着脂肽浓度的增加对酶活性的抑制作用逐渐增强。SDH参与细胞的能量代谢，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一。MDH可以催化苹果酸与草酰乙酸间的可逆转换，是参与细胞的生物合成代谢的关键酶之一。脂肽对酶活性得不同程度的影响表明其能够通过影响酶的活性来改变细胞的代谢。此外，脂肽还能够抑制点青霉对糖类及蛋白质利用，导致点青霉生长受阻［41］。

4 Surfactin应用的研究进展

4.1 医药领域中的应用

抗生素的滥用导致细菌耐药性问题的出现已经逐渐成为医学界迫在眉睫的难题，可代替抗生素的新药物的开发势在必行［42］。Surfactin特殊的两亲型结构，能够与细菌细胞膜结合并将其非极性端插入到细胞膜的疏水孔中，破坏细胞的完整性，干扰细胞正常代谢从而起到抑菌作用［43］。研究表明，Surfactin在临床上能有效对抗粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)、变形杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等耐药菌［44］;Surfactin可抑制鼠细胞脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)介导生成的炎症介质，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)和一氧化氮合酶，减缓由LPS引起的真核细胞感染［45］。近年来，Surfactin 在抗病毒制剂［25］、抗肿瘤制剂［46］、溶血栓制剂［47］、口服免疫佐剂［48］、乙肝疫苗［49］以及糖尿病治疗［50］等方面中的应用研究也取得了突破，Surfactin在医药领域中扮演着越来越重要的角色。

4.2 动物养殖中的应用

抗生素类促生长添加剂在动物养殖过程中长期使用会导致其耐药性、药物残留和环境污染等问题，探寻新型抗菌药物越来越受到重视。Surfactin具有独特杀菌机制和抗菌广谱性，且病原菌不易对Surfactin产生耐药性，正逐渐进入人们的视野。一方面，Surfactin具有较好的热稳定性和化学稳定性，不仅在加工过程中能有效防治病原菌对原料的感染，而且能保证其经过加工之后，仍然保持较高的抗菌活性;另一方面，Surfactin分子质量较小，经动物食用后进入肠道可以有效抑制体内病原微生物的生长繁殖，调节肠道菌群平衡，并不易产生耐药性和残留［51］。近年来，关于Surfactin在动物养殖中应用的报道日益增多。由于抗菌脂肽Surfactin可导致嗜水气单胞菌细胞膜通透性增加，使细胞内一些离子以及大分子的蛋白质和核酸泄漏到细胞外，从而引起细胞的死亡，其被认为可用于嗜水气单胞菌感染引起的水生动物疾病预防和控制［19］。研究表明，点带石斑鱼(Epinephelus coioides)饲料中添加20 mg/kg Surfactin可增强鱼体免疫力以对抗溶藻弧菌等病原菌的感染［18］;诱导石斑鱼AMPs、干扰素诱导蛋白和黏病毒抗性蛋白等先天型免疫基因的表达，显著提高增重率;降低感染神经坏死病毒(Necrosis cirus)和虹彩病毒(Irido virus)石斑鱼的死亡率［52］。史庆超等［53］在吉富罗非鱼饲料中添加12.5 mg/kg的抗菌脂肽Surfactin即可显著提高增重率、肠道脂肪酶和蛋白酶的活性。石广举等［54］发现，在凡纳滨对虾饲料中添加100 mg/kg NT-6抗菌脂肽(活性成分为Surfactin、Fengycin和Iturin同系物)可抑制水体和虾体中弧菌的生长，提高对虾增重率和特定生长率。饲料中添加4 000 U/kg抗菌脂肽(活性成分为 Surfactin、Fengycin及其同系物)，可对艾拔益加(AA)肉鸡的生长发育和免疫机能具有较好的调节和促进作用［55］，还能提高抗氧化机能和促进蛋白质的代谢［56］;提高断奶仔猪生长性能，抑制仔猪断奶应激造成的腹泻和肠道有害微生物，但对有益微生物也有一定的抑制作用，有效调节血液激素水平和某些生化指标，提高机体对脂类的转化利用能力和蛋白质的沉积能力［57］。研究表明，断奶仔猪饲料中添加150 mg/kg抗菌脂肽替代75 mg/kg金霉素，可促进采食，提高日增重，显著改善饲料报酬，并显著降低腹泻率［58］;Surfactin与枯草芽孢杆菌联用也可以促进断奶仔猪肠道内有益菌增殖，改善肠道微生态环境，提高机体全身的免疫应答反应［59］。随着更多关于Surfactin在动物饲料中应用的研究，Surfactin有望成为新型绿色抑菌促生长饲料添加剂在动物养殖中广泛应用。

4.3 农业生物防治中的应用

研究表明，Surfactin对豆科作物灰霉病［60］、水稻细菌性条斑病［61］、黄瓜枯萎病［62］和生菜霜霉病［63］等具有显著的防治效果。Waewthongrak等［64］还发现，枯草芽孢杆菌ABS-S14发酵粗提物(活性成分为Surfactin、Iturin A和Fengycin)可诱导植物过氧化物酶和L-苯丙氨酸解氨酶等抗病有关酶的活性的增强，强烈抑制绿霉菌(Penicilium digitatum)Sacc的生长，降低柑桔类水果患病率。Surfactin还可替代化学表面活性剂，作为分散剂、农药助剂提高化肥和农药的使用效率［65-66］。

4.4 食品加工和保鲜中的应用

食品加工过程中，Surfactin可促进脂肪乳化，控制脂肪聚集，有利于食品的加工，并保持食品的质地和口感［67］。Surfactin的抗菌活性能有效控制食品中有害微生物的滋生，可作为生物防腐剂应用在食品防腐保鲜领域［68］。研究表明，Surfactin可有效抑制乳中大肠杆菌 O157，延长乳保质期［69］;纳豆菌抗菌肽APNT-6(活性成分为Surfactin、Fengycin和Iturin)可减缓凡纳滨对虾贮藏过程中pH、挥发性盐基氮和细菌总数增加，延长2～3 d货架期［70］，Surfactin还能减缓肉制品储藏过程中pH的上升，防止脂肪氧化，对肉制品储藏起到良好的保鲜效果［51］。

4.5 其他领域中的应用

Surfactin优良的表面性能使其在原油采收、环境修复和化妆品等领域的应用也颇具优势。Al-Wahaibi等［71］报道由枯草芽孢杆菌B30产Surfactin能分别提高17%～26%轻质油采收率和31%稠油采收率。石油开采、运输、加工及储存过程中，难以避免地会排入环境对土壤、水体造成污染。加入生物表面活性剂乳化烃类和水的混合液，增加烃类的降解是目前治理油污的有效方法之一。Singh等［72］以Surfactin为主要成分的脂肽生物表面活性剂洗涤含有石油烃的土壤，去除率达64.5%。通过利用Surfactin对重金属离子的络合作用，提高驱除土壤中重金属的效率成为环境保护研究中的热点之一［72-73］。此外，Surfactin可以改善化妆品的水洗性能，增加皮肤的光润和滑嫩性［74］，在化妆品领域中应用也极具吸引力。

5 小结与展望

Surfactin优良的抗菌活性和特殊的抗菌机制使其有望成为抗生素潜在替代品之一，在医药、动物养殖、农业生物防治以及食品加工和保鲜等领域具有巨大的应用价值。但目前Surfactin在生产实践中广泛应用仍然面临着一些挑战:1)Surfactin的抗菌机制尚不明确，关于Surfactin作用机制的研究多为体外模型模拟，而对Surfactin在生物体内作用研究甚少;2)Surfactin发酵生产产量一般较低，受其特殊的两亲性质的影响，Surfactin分离提纯成本较高，大规模商品化生产至今还未实现，极大限制了Surfactin的应用。因此，通过改良生产菌株、改善发酵生产工艺和选择适合的廉价的发酵底物等途径提高Surfactin产量仍将是今后科研人员重点研究课题之一;3)Surfactin在不同领域中适宜的添加剂量有待研究，虽然毒理试验证明Surfactin的急性毒性属实际低毒或无毒级，但过高的浓度可能诱发细胞溶血，对细胞产生毒性仍然令人担忧。因此，Surfactin安全有效的用量还需进一步评估。随着人们对Surfactin研究的深入和生物工程技术的不断进步，Surfactin的应用必将取得突破性进展。

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