具有E3泛素连接酶功能的痘病毒蛋白质

陈轶霞，邵忠伟，李贵华，王 聪

(西北民族大学生命科学与工程学院生物工程实验室，兰州 730124)

具有E3泛素连接酶功能的痘病毒蛋白质

陈轶霞*，邵忠伟，李贵华，王 聪

(西北民族大学生命科学与工程学院生物工程实验室，兰州 730124)

泛素化是蛋白质的翻译后共价修饰过程，可以调节蛋白质的稳定性，涉及多种生理功能。痘病毒在进化过程中形成了扰乱和操纵宿主细胞泛素系统的多种机制，包括编码多种能干扰宿主泛素系统的病毒蛋白质。近年的研究表明痘病毒编码许多具有泛素连接酶活性的蛋白质，如膜相关RING-CH(MARCH)结构域蛋白、p28/Really Interesting New Gene(RING)finger蛋白、锚蛋白重复序列/F-box蛋白、Bric-a-Brac Tramtrack Broad complex(BTB)/Kelch蛋白及APC家族蛋白等。作者在本文着重阐述了痘病毒编码的E3泛素连接酶功能蛋白的研究概况。

痘病毒；E3泛素连接酶；功能蛋白

痘病毒科(Poxviridae)病毒是在细胞质中复制的双链DNA病毒，大约编码200多种蛋白质。该科分为两个亚科：脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)和昆虫痘病毒亚科(Entomopoxvirinae)。脊椎动物痘病毒亚科包含八个属[1]。

许多病毒在进化过程中形成了有利于自身的操纵和调控宿主泛素(ubiquitin，Ub)系统的机制。它们可以编码泛素连接酶和去泛素化酶，也能劫持泛素化系统的组件去靶向一些细胞的成分[2-3]。此外，病毒可以将泛素化作为一种可逆的翻译后修饰过程，用有限的病毒蛋白质来履行更多的生物功能。例如，人免疫缺陷病毒Gag蛋白[4]和埃博拉病毒VP40蛋白[5]因病毒粒子的出芽和释放而被泛素化，流感病毒NP蛋白的泛素化和去泛素化与病毒复制有关[6]。另外，宿主细胞可以将某些病毒蛋白的泛素化作为限制病毒增殖的机制，如黄病毒NS5蛋白[7]或人乳头状病病毒E7蛋白[8]。痘病毒同样也有调控Ub系统的多个机制[9-10]，它们能够编码自己的Ub连接酶，或者直接抑制细胞E3连接酶的功能，如A49或PACR[11-12]。此外，对痘苗病毒的研究表明病毒完成一个生命周期需要活性蛋白酶体[13]。

泛素化是一种翻译后修饰过程，包括一个高度保守的8 ku Ub与受体蛋白的共价连接。这个过程至少包括一个高度保守的三酶级联(E1-E2-E3)反应，即需要E1活化酶活化泛素，随后转移泛素到E2泛素结合酶，再通过E3泛素连接酶将活化泛素转移到蛋白质底物。E3泛素连接酶决定靶标蛋白的特异性[14]。

迄今为止，发现鉴定的E3连接酶可以分为五大类。第一类为HECT结构域家族蛋白质；第二类包括c-Cbl、Mdm2、凋亡蛋白抑制因子以及其他包含RING finger结构域的蛋白质，这类连接酶的单个多肽链中通常既包含E2结合域，也包含底物识别基序；第三类 E3连接酶由大蛋白质复合物组成，其包含一个由cullin和RING-CH异二聚体组成的最小的连接酶核心构件，比如SCF、APC和VBC复合物；第四类为U-box蛋白家族；第五类被称为膜相关RING-CH(membrane-associated RING-CH，MARCH)蛋白，它的氨基末端包含一个RING-CH结构域，其后紧随着两个跨膜结构域[15]。本文主要对当前已经发现并鉴定的痘病毒编码的泛素连接酶功能蛋白进行综述，以促进对痘病毒与宿主泛素系统相互作用机制的进一步深入研究。

1 痘病毒编码的E3泛素连接酶功能蛋白

痘病毒编码许多具有内在活性的泛素连接酶，包括膜相关RING-CH(MARCH)结构域蛋白、p28/Really Interesting New Gene(RING)finger蛋白、锚蛋白重复序列(Ankyrin repeats，ANK)/F-box蛋白、Bric-a-Brac Tramtrack Broad complex(BTB)/Kelch亚蛋白及APC家族蛋白等。迄今发现的痘病毒编码的E3泛素连接酶见表1。

表1 痘病毒编码的代表性E3泛素连接酶家族成员

Table 1 Representative E3 ubiquitin ligase family members encoded by poxviruses

miRNAs功能Function靶基因Target参考文献ReferencemiR⁃122胆固醇水平相关CAT1[26]miR⁃196a↑脂肪形成-[40]miR⁃103↑脂肪形成RAI14[27，44]miR⁃27a↓脂肪形成-[20]miR⁃143↑脂肪形成-[20]miR⁃145↓脂肪形成IRS1[52]miR⁃181↑脂肪形成TNFα[53]miR⁃33b↓脂肪形成EBF1[54]miR⁃199a⁃5p↓脂肪形成Cav1[58]miR⁃130b↓脂肪形成PPARγ[62，63]miR⁃374a/b-C/EBPβ[62，64]

1.1 痘病毒编码的MARCH E3泛素连接酶

病毒编码的MARCH E3泛素连接酶的一个特点是其氨基端存在RING-CH finger结构域，后面通常紧跟着两个跨膜结构域。这一蛋白家族普遍被称为MARCH蛋白。痘病毒的MARCH E3泛素连接酶的模型见图1A。

黏液瘤病毒 (myxoma virus，MV)编码的含RING-CH的蛋白M153R是病毒早期表达的毒力因子，在瞬时转染的细胞中定位于内质网和高尔基体反面网状结构[16]。M153R能够下调宿主细胞表面MHC-1类分子、促凋亡因子 CD95(Fas)和白细胞活化黏附因子(activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM)的表达[17]。M153R还具有抑制CD4分子的作用，类似于其对MHC-1类分子的作用[31]。在MV感染过程中，M153的RING-CH结构域作为泛素连接酶，识别CD4 尾部的赖氨酸残基，使CD4的胞质尾泛素化，再通过内吞作用和随后溶酶体的降解导致其内化。M153R诱导的细胞表面免疫分子的泛素化和降解，是MV抑制免疫应答的一个重要机制。

A.膜相关RING-CH(MARCH)泛素连接酶，MARCH包含两个跨膜结构域和N-末端RING-CH域；B.p28/RING泛素连接酶，包含一个C-末端RING结构域和N端KilA-N DNA结合结构域；C.后期促进复合物(APC)，推测PACR取代了APC11，从而破坏了APC的功能；D.ANK/F-box泛素连接酶，cullin-1与SKP-1相互作用，SKP-1又与ANK/F-box蛋白相互作用，ANK域与底物相互作用，将其招募到cullin-1泛素连接酶；E.BTB/Kelch(BBK)泛素连接酶，BBK蛋白通过BTB结构域与cullin-3相互作用，通过kelch域招募底物A．Membrane associated RING-CH(MARCH) ubiquitin ligase，MARCH contains two transmembrane domains and a N-terminal RING-CH domain；B.p28/RING，p28 contains a C-terminal RING domain and a N-terminal KilA-N DNA binding domain；C.Anaphase Promoting Complex(APC)，it is hypothesized that PACR displaces APC11 subsequently disrupting APC function；D.ANK/F-box ubiquitin ligases，cullin-1 interacts with SKP-1，which in turn interacts with ANK/F-box proteins.The ANK domain potentially interacts with substrates recruiting them to the cullin-1 ubiquitin ligase；E.BTB/Kelch(BBK) ubiquitin ligases，BBK proteins interact with cullin-3 through their BTB domain.Potential substrates are likely recruited through the kelch domain图1 不同种类的痘病毒E3泛素连接酶示意图[9，30]Fig.1 A schematic of different classes of poxvirus E3 ubiquitin ligases

1.2 痘病毒编码的p28/RING finger蛋白

正痘病毒属成员鼠痘病毒(ectromelia virus，EV)编码的一个28 ku的蛋白质(p28-RING蛋白)是一种具有RING finger泛素连接酶活性的重要的毒力和抗凋亡因子[18]，在病毒感染早期和晚期均有表达。其他正痘病毒属成员中也鉴定出了p28-RING 蛋白的同源物，如天花病毒(Variola virus，VARV)、牛痘病毒(cowpox virus，CPXV)、猴痘病毒(monkey pox virus，MPXV)和痘苗病毒(vaccinia virus，VV)IHDW株等[32]。在兔痘病毒属的2个成员兔纤维瘤病毒(shope fibroma virus，SFV) 和MV的基因组中也发现了与p28-RING 蛋白同源的蛋白[19，31]，鸡痘病毒基因组内也存在10个与 p28-RING蛋白具有同源性的ORFs[21]。

p28蛋白包含两个功能结构域：C末端RING zinc finger结构域和N末端KilA-N DNA结合域(图1B)。研究证明，在病毒感染过程中，p28被泛素化，与共轭泛素共定位于被称为“病毒工厂”的病毒复制的细胞质区域。p28的泛素连接酶活性依赖其C末端的RING finger结构域，RING finger域缺失或突变，能使其丧失泛素连接酶活性[19-20，33]。在许多大DNA病毒以及细菌和噬菌体中也发现了KilA-N DNA结合域[34]。p28在“病毒工厂”的定位依赖KilA-N DNA结合域[35]。有趣的是，在鸡痘病毒(fowlpox virus，FWPV)编码的8个KilA-N蛋白和金丝雀痘病毒编码的23个KilA-N蛋白中，只有两个与RING结构域配对，其余的KilA-N结构域与“未知功能域”相关，或是KilA-N-only域，这些蛋白质的功能目前尚不清楚[36]。体外泛素化检测表明，VV-IHDW株和VARV的p28同源物也具有泛素连接酶的功能，VARV的p28同源物D4R在体外与泛素结合酶Ubc4和UbcH5c一起发挥作用[19，33]。有些痘病毒编码的p28同源物与p28的亲缘关系较远，如黏液瘤病毒编码的M143R、禽痘病毒编码的FWPV150 和FWPV157。尽管这些蛋白质与p28的序列相似性较低，但对泛素连接酶功能至关重要的半胱氨酸和组氨酸残基却是高度保守的，且KILA-N结构域的关乎DNA结合的关键残基44-51残基也很相似。研究证明，M143R、FPV150和FWPV157也在感染期间被泛素化，并与结合泛素共定位于“病毒工厂”[21]，说明p28及其同源物的功能在痘病毒家族的成员之间是高度保守的。

像许多细胞泛素连接酶一样，p28在病毒感染过程中受到蛋白酶体降解和泛素化的严格调控，还可通过自身泛素化进行自我调节[20]。p28及其同源物能催化形成赖氨酸-63(K63)和赖氨酸-48(K48)连接的泛素链，通过-K48形成的泛素链与蛋白酶体降解靶蛋白的作用相关，而-K63链充当介导信号转导的支架，或改变靶蛋白的亚细胞定位。可以推测，p28及其同源物在病毒的感染过程中可能发挥着较为复杂的生物功能。已经有研究表明，在鼠痘病毒感染的过程中，p28参与抑制病毒感染诱导的细胞凋亡，从而促进病毒复制[37]。另外，p28及其同源物在先于“病毒工厂”形成的感染早期也有表达，表明早期的p28可能泛素化其他蛋白质[21]。由于p28及其同源物定位于病毒工厂，所以病毒工厂中很可能存在潜在底物。

虽然在阐明p28 及其同源物的E3泛素连接酶活性，以及其与病毒体外复制和体内逃避宿主的抗病毒效应之间的联系等方面取得了巨大的进展，但还有很多问题需要进一步研究。例如其宿主的和/或病毒的靶标底物的特性和数量、调控其催化活性的机制以及抗凋亡反应的机制尚不清楚。

1.3 痘病毒的APC家族E3泛素连接酶

后期促进复合物(anaphase-promoting complex，APC)或细胞周期体是已知最大的细胞泛素连接酶复合物，至少由12亚基组成(图1C)。APC催化泛素连接到分离酶抑制蛋白和有丝分裂细胞周期蛋白的赖氨酸侧链[38]。APC的亚基APC2(cullin 家族的远亲成员)和 APC11(一个RING-H2 finger蛋白)组成APC的最基本的泛素连接酶组件[39]。

最近的研究发现，痘病毒的RING-finger蛋白家族与APC11的RING结构域有相似的序列。如鳄鱼痘病毒(crocodile poxvirus，CRV)CRV047蛋白[40]、传染性软疣病毒(molluscum contagiosum virus，MOCV) MC026L蛋白[41]、羊口疮病毒(contagious pustular dermatitis virus，ORFV)PACR蛋白[12]。这些痘病毒蛋白质都包含一个类似于APC11 的RING-H2 基序修饰的RING-finger结构域。ORFV PACR(痘病毒的APC/细胞周期调节器)是迄今研究的唯一的APC11同源物。 PACR被证明能与APC亚基APC2、APC3和APC4共沉淀，并且以与APC11一样的方式与APC复合物相互连接。然而，序列分析发现，PACR和其他痘病毒PACR同源物包含能抑制E2泛素结合酶结合到复合物的RING结构域的突变，从而抑制底物泛素化。APC的抑制可促进细胞进入S期，细胞周期的这一阶段可能存在另外的有助于病毒复制的细胞因子。另外，APC的两个靶标，即细胞的核糖核苷酸还原酶和胸苷激酶蛋白，在DNA合成所需的游离核苷酸池发挥作用。痘病毒通常编码自身的胸苷激酶和核糖核苷酸还原酶基因，然而，病毒胸苷激酶和核糖核苷酸还原酶基因在ORFV以及其他编码PARC同源物的病毒中不存在。与此相反，许多缺乏PACR同源基因的病毒编码自身胸苷激酶基因。推测编码APC抑制剂的主要原因之一就是上调细胞胸苷激酶和核糖核苷酸还原酶基因，以弥补游离核苷酸池功能的缺陷[12]。这些病毒蛋白质在E3 泛素连接酶复合物的形成和调控中的功能仍需进一步研究。

1.4 痘病毒编码的ANK/F-box蛋白

锚蛋白重复序列和F-box结构域蛋白是痘病毒编码的大分子蛋白质家族之一，大小在400～650个氨基酸之间，其N-末端有5～10个ANK重复序列，C-末端包含与F-box结构域相类似的保守序列，具有将底物募集到细胞SCF(SKP-1、cullin、F-box)泛素连接酶复合物上的功能[42](图1D)。痘病毒的F-box样结构域后来被命名为PRANC(pox protein repeats of ankyrin-C terminal，PRANC)。

许多痘病毒编码ANK/PRANC蛋白。对黏液瘤病毒的研究首次发现了痘病毒ANK/PRANC蛋白与SCF复合体之间的相互作用。MT-5是黏液瘤病毒编码的4个ANK/PRANC蛋白(M-T5、M148、M149、M150)的其中之一，其N末端有7个ANK重复序列结构域，C末端有1个F-box基序，与cullin-1共定位于细胞核，调节细胞周期和与Akt蛋白的相互作用[22-23]。黏液瘤病毒编码的这4个ANK/PRANC蛋白都在病毒的毒力中发挥作用，缺乏所有的ANK/PRANC蛋白的重组黏液瘤病毒促进了细胞的多种抗病毒通路，毒力极大减弱[24，43]。M150的N-末端有9个的ANK重复序列，C-末端有一个F-box结构域，是细胞SCF复合物的一部分，与核转录因子κB(NF-κB)的p65亚基共定位于细胞核，表明M150涉及对NF-κB的抑制[44]。M148蛋白有10个ANK重复序列，定位在细胞质和细胞核中。M149蛋白中有9个ANK重复序列，以点状形式均匀分布在细胞质中。病毒在培养的细胞中的增殖都不需要M148和M149蛋白，但它们却都是 MV 感染家兔的毒力因子[24]。M148、M149 和 M150的结合伴侣和潜在的目标底物尚不清楚。体外泛素化测定证明羊口疮病毒编码的5个ANK/PRANC蛋白均与SCF泛素连接酶复合物的功能相关[26]。 同样，鼠痘病毒、牛痘病毒和痘苗病毒蛋白的F-box结构域也是与SCF复合体相互作用所必不可少的[25，27，45]。鼠痘病毒编码的4个ANK/PRANC蛋白(EVM002、 EVM005、EVM154、EVM165)靶向SCF阻止NF-κB 抑制剂 IκBα的降解，抑制NF-κB 的核转运[27]。牛痘病毒编码的ANK/PRANC蛋白CP77是一个宿主范围蛋白，与NF-κB转录因子p65相互作用，抑制炎性细胞因子的转录[45]。利用酵母双杂交筛选，发现天花病毒编码的G1R ANK/PRANC蛋白与NF-κB调节蛋白NFκB1/p105以及SKP1有关联。G1R及其牛痘病毒、猴痘病毒和鼠痘病毒的G1R同源物(CPXV006、MPXV003、EVM002)都能结合p105，并在TNFα刺激后，抑制G1R的降解[46]。此外，CPXV006缺失病毒在培养的细胞中显示出促炎细胞因子释放的增加，并且感染C57BL/6小鼠后，毒力轻微减弱[47]。总之，痘病毒很可能利用这些ANK/PRANC蛋白为SCF1泛素连接酶招募新的靶蛋白，并利用宿主的泛素-蛋白酶机制降解特异的细胞(也可能是病毒的)蛋白质以帮助病毒复制。痘病毒ANK/PRANC蛋白对NF-κB信号通路的调控似乎是一个共同的趋势。

1.5 痘病毒编码的BTB/Kelch(BBK)蛋白

BTB(Bric-a-Brac Tramtrack Broad complex，BTB)结构域是一个高度保守的蛋白-蛋白相互作用基序，涉及许多细胞功能。BTB蛋白的BTB结构域与cullin-3和kelch、MATH或Zinc Fingers等底物招募域连接，介导依赖cullin-3的泛素连接酶复合物的cullin与底物的结合，使靶蛋白泛素化[48](图1E)。痘病毒是已知的唯一编码 BTB-BACK-Kelch(BBK) 蛋白的病毒家族。例如，痘苗病毒编码3个BBK蛋白[49]；牛痘病毒编码6个BBK蛋白[50]；鼠痘病毒株Moscow株(EVM)编码4个BBK蛋白[51]；猴痘病毒只编码一个BBK蛋白[52]。

鼠痘病毒编码的BTB/kelch蛋白EVM150和EVM167的BTB结构域是与cullin-3连接所必需的；EVM150 和 EVM167与共轭泛素、Roc1相互作用，Roc1是一个有活性的cullin-3泛素连接酶复合物所必需的RING-finger蛋白[28]。新近的研究表明，EVM150能够抑制宿主的NF-κB通路，且其作为cullin-3泛素连接酶复合物的适配器的功能并不依赖它的kelch结构域[53]。

有证据表明在痘病毒的生命周期中BBK蛋白具有重要作用。缺乏BTB/kelch蛋白C2L、F3L或A55R的痘苗病毒皮下注射小鼠模型后，发病机制发生改变，但是它们在宿主细胞泛素通路中的作用仍不清楚[54-56]。缺失BTB/kelch基因D11L、C18L、G3L和A57R的牛痘病毒GRI-90株，也导致宿主范围改变和毒力减弱[29]。另据报道，绵羊痘病毒的BBK蛋白SPPV-019是一个重要的毒力因子。利用SPPV-019基因敲除的病毒模型，发现SPPV-019具有调节细胞黏附和影响病毒毒力的作用[57]。这些观察结果表明，BTB/KELCH蛋白质能操纵细胞宿主环境。然而迄今为止，还没有鉴定出痘病毒BBK蛋白的确切底物。有趣的是，最近通过酵母双杂交筛选发现，痘苗病毒编码的BBK蛋白WR026(COP-C2L)与一个小的热休克蛋白，细胞晶状体蛋白alpha B(CRYAB)有相互作用[58]。WR026能否调控alpha B以发生cullin-3介导的泛素化需要进一步研究。虽然大多数痘病毒BBK蛋白的具体作用还不清楚，但据推测，它们可充当cullin-3底物特异性的连接蛋白，类似于它们在细胞中的作用。所有的痘病毒BBK蛋白是否都参与泛素通路，或靶向宿主的其他通路，有待进一步研究。未来，鉴定其靶向的底物将对了解细胞抗病毒反应提供新的视野。

2 展 望

自从首次发现痘病毒编码的蛋白质具有泛素连接酶活性以来，该领域以令人鼓舞的步伐迅速迈进。从目前的研究来看，痘病毒能编码操纵泛素-蛋白酶体系统多种蛋白质。包括痘病毒编码的泛素、泛素连接酶以及作为 E3泛素连接酶复合物组分的蛋白质、泛素通路的抑制剂、效应器等。虽然对痘病毒蛋白质在操纵宿主泛素系统中的作用的理解取得了一定的进展，但仍有许多重要问题有待解决。目前对痘病毒E3泛素连接酶的理解还很有限，包括许多E3泛素连接酶的确切底物的鉴定以及它们的相关功能。此外，确定痘病毒编码的E3泛素连接酶是否具有通过序列预测而得出的转运蛋白酶体的功能也很重要。鉴于痘病毒与宿主之间复杂的相互作用，未来有关泛素系统如何在痘病毒生命周期中重新配置的研究，可能同时揭示出缺乏病毒感染时，这些重要的宿主细胞通路的新的功能。

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(编辑 白永平)

Poxvirus Encode Proteins with E3 Ubiquitin Ligase Function

CHEN Yi-xia*，SHAO Zhong-wei，LI Gui-hua，WANG Cong

(CollegeofLifeScienceandEngineering，NorthwestUniversityforNationalities，Lanzhou730124，China)

Ubiquitylation is a covalent post-translational modification that regulates protein stability and is involved in many biological functions.Many poxviruses have evolved multiple mechanisms to perturb the cell ubiquitin system and manipulate it to their own benefit.Such as the poxvirus family encode ubiquitin ligases with intrinsic activity，including the membrane-associated RING-CH(MARCH) domain，p28/Really Interesting New Gene(RING) finger，ankyrin-repeat/F-box and Broad-complex，Tramtrack and Bric-a-Brac(BTB)/Kelch subgroups of the E3 Ub ligase superfamily.Here we describe and discuss the proteins with E3 ubiquitin ligase function encoded by poxvirus.

poxvirus；E3 ubiquitin ligase；functional protein

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.002

2015-05-05

国家自然科学基金(31260609；31560697)

陈轶霞(1969-)，女，甘肃陇西人，教授，博士，硕士生导师，主要从事动物重大疫病病原分子生物学研究，E-mail：chenyx69@126.com

S855.3；S852.659.1

A

0366-6964(2015)12-2127-08

*通信作者：陈轶霞