FSH、LH对体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞凋亡及E2、P分泌功能的影响

徐庚全，樊江峰，2，杨世华，李谷月，赵华山，余四九，2*

(1.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070；2.甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心，兰州 730070)

FSH、LH对体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞凋亡及E2、P分泌功能的影响

徐庚全1，樊江峰1，2，杨世华1，李谷月1，赵华山1，余四九1，2*

(1.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070；2.甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心，兰州 730070)

为了探明促卵泡素(Follicle stimulating hormone，FSH)和促黄体素(Luteinizing hormone，LH)对体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞凋亡及甾体激素分泌的影响，揭示促性腺激素调控卵泡发育的机理，采用细胞培养和显微观察技术，建立了牦牛卵泡颗粒细胞体外培养体系，观察分析牦牛卵泡颗粒细胞体外培养的生长特征和凋亡的形态特征；采用流式细胞技术(Flow cytometry，FCM)和放射免疫测定技术(Radioimmunoassay，RIA)，分析了添加不同浓度的FSH和LH对牦牛卵泡颗粒细胞凋亡和雌二醇(Estradiol，E2)、孕酮(Progesterone，P)分泌的影响。结果显示，体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞呈现出典型的上皮样细胞生长特性，具有典型的“S”形生长曲线，体外培养的牦牛颗粒细胞偶尔可见细胞核浓缩、边集化、染色质固缩、内质网疏松等凋亡的形态特征。在添加0.050～5.000 IU·mL-1FSH，随着浓度的增加，凋亡细胞比例逐渐降低，E2和P水平呈上升趋势；在添加浓度达到5.000 IU·mL-1时，凋亡细胞比例最低降到7.3%，与对照组差异极显著(P<0.01)。低浓度的LH(0.050～0.500 IU·mL-1)，可以抑制颗粒细胞凋亡，促使E2和P分泌增加；高浓度的LH(5.000 IU·mL-1)则促使颗粒细胞凋亡，对颗粒细胞分泌E2和P的影响不明显。这一结果表明，FSH和LH可通过调节牦牛颗粒细胞的凋亡及分泌功能，在调控卵泡发育及排卵的过程中发挥重要作用。

牦牛；促性腺激素；颗粒细胞；细胞凋亡；激素分泌

哺乳动物卵巢上有大量处于不同发育阶段的卵泡，但只有少数卵泡能够发育成熟并排卵，大约99%的卵泡在发育的不同阶段发生闭锁[1-2]。卵泡闭锁是卵泡从发育到排卵前所发生的退化并最终被清除的生理现象，主要通过细胞凋亡(Apoptosis)而实现，对维持卵巢内环境的稳定至关重要。颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞，其增殖与分化直接影响着卵泡的生长发育、排卵、黄体形成以及甾体激素分泌等卵巢功能活动[3]。颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的主要机制。在发育卵泡中，如果10%以上的颗粒细胞发生凋亡，那么该卵泡将注定发生闭锁[4-5]。相反，颗粒细胞增殖和类固醇生成是卵巢功能维持和发挥作用的关键环节。在哺乳动物体内，卵泡的发育和排卵主要受促性腺激素的调控，尤其是FSH和LH在卵泡不同发育阶段的变化规律已有报道。现已普遍认为，FSH 可以促进有腔卵泡和排卵前卵泡的生长；少量的LH与FSH 协同促进卵泡发育成熟并分泌雌激素。另外在卵泡发育成熟时，LH 是触发排卵的主要因素[6]。有关FSH和LH 对体外条件下卵泡颗粒细胞的作用未见报道。本试验在卵泡颗粒细胞体外培养的基础上，通过添加不同浓度的FSH和LH，采用流式细胞技术和放射免疫技术，分析颗粒细胞的凋亡情况和分泌E2及P的能力，为卵泡闭锁机理的研究奠定理论基础。

1 试验方法

1.1 样品采集

卵巢样品采自甘肃省甘南藏族自治州玛曲藏族自治县屠宰场，母牦牛放血致死后，迅速采集卵巢组织，用灭菌PBS (pH7.2) 冲洗3次，放入含青霉素(100 IU·mL-1)和链霉素(100 μg·mL-1)的37 ℃ PBS缓冲液中，6 h 内带回实验室。

1.2 颗粒细胞的培养

用带12号针头的注射器逐个抽吸2～6 mm卵泡中的卵泡液，加入15 mL离心管中，反复吹打使颗粒细胞充分分散后离心(1 000 r·min-1，5 min)，弃上清。细胞沉淀用含DMEM-F12(Gibco) 离心洗涤3次。用含有10%胎牛血清的DMEM-F12培养液重悬，调整细胞密度到1.0×106mL-1，接种于60 mm 培养皿，置于 5% CO2培养箱中38.0 ℃培养，倒置显微镜下观察细胞并照相，记录细胞生长情况。

1.3 生长曲线绘制

调整细胞密度到1×104mL-1、每孔1 mL接种于24孔板，接种时间记为0 d。从接种时间算起，每隔1 d用血细胞计数板计数3个孔内的细胞密度，并求出平均值，对每孔细胞计数3次，取其平均值，检测到第8天结束。以培养时间为横坐标，细胞密度为纵坐标，取平均值绘制细胞生长曲线。绘图法计算细胞群体倍增时间。

1.4 凋亡细胞的形态观察

用于形态观察的细胞，接种前事先在培养皿中放置盖玻片，将细胞悬液接种于盖玻片上，5% CO2、38.0 ℃培养36 h后，取出盖玻片，瑞特氏染色，显微镜下观察、照相。

1.5 体外培养颗粒细胞凋亡形态的电镜观察

PBS漂洗收集的卵泡颗粒细胞，离心成小块沉淀，用1%琼脂糖包被沉淀物，迅速加入20倍以上体积的2.5%的戊二醛中固定2 h，制成超薄切片，枸橼酸铅、醋酸铀双重染色，电镜(JEM-1200EX，日本)下观察、拍照。

1.6 颗粒细胞凋亡和激素分泌的检测

细胞培养12 h 后弃去培养液及没有贴壁的死细胞，用无血清的培养液漂洗3次，每孔添加 1 mL 无血清培养液培养8 h后，根据试验设计加入相应浓度的激素，继续培养24 h，吸取上层培养液，1 000 r·min-1离心10 min去除杂质颗粒和聚合物，分别使用雌二醇和孕酮放免试剂盒(北京北方生物技术研究所)按照试剂盒说明书，测定培养上清液中E2和P的含量。贴壁细胞用0.25%胰酶和0.02%EDTA溶液消化细胞，制成单细胞悬液。将细胞悬液离心(1 000 r·min-1，5～10 min)，弃上清，加入-20 ℃ 70%的乙醇5 mL固定，-20 ℃冰箱保存，碘化丙啶染色后，流式细胞仪(FACS Calibur，美国Becton Dicknson)检测细胞凋亡率。

1.7 统计学方法

数据以“平均数±标准差”表示，采用SPSS 10.0 for Windows 统计分析软件进行统计学处理，各组间比较用方差分析，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结 果

2.1 牦牛卵泡颗粒细胞体外培养的形态特征

体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞呈现出典型的上皮样细胞生长特性。接种2 h 后，细胞开始黏附于培养皿底部；6 h 后，可见颗粒细胞有彼此接近运动现象，12 h 后，可观察到颗粒细胞呈现聚集生长特性，即较为分散的颗粒细胞通过自身的运动聚集成片，尤其在培养皿中部较为明显；培养24 h 后，颗粒细胞开始贴壁生长，细胞呈梭形、放射状或星形等不规则多边形，细胞之间通过伸出的伪足相互接触；培养 48 h 后，聚集区域细胞间连接紧密，形成“铺路石”样单层排布，胞膜边缘清晰，折光性强；胞质的透光性也较好，镜下可见胞内有小颗粒，无空泡现象；72～96 h内细胞可长满平皿底，形成颗粒细胞单层(图1A～C)。定时取样，细胞计数结果表明，牦牛卵泡颗粒细胞生长曲线呈典型的“S”形(图1D)。0～2 d是其生长潜伏期，3～6 d 为指数生长期，7 d 后进入停滞期，根据细胞生长曲线可知牦牛卵泡颗粒细胞的群体倍增时间为64～72 h(表1)。

2.2 体外培养牦牛卵泡颗粒细胞凋亡的形态特征

在体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞中，笔者观察到了典型的细胞凋亡特征。瑞特氏染色，光镜下观察，正常颗粒细胞充分伸展，边缘不清楚，有大量伪足伸出；胞质丰富，呈淡紫色，着色均匀；核大，呈紫色着色均匀，核膜清晰。凋亡颗粒细胞随着时间的延长，呈现出典型的凋亡特征。首先细胞边缘收缩而变得清晰，核染色变深，然后核形状发生变化，出现哑铃型、月牙形等不规则形状，核染色质进一步浓缩并边集化，固有结构逐渐消失；最后，核分裂固缩成团，但核膜完整，仅有少量胞质包裹其外，并进一步裂解为凋亡小体(图2 a～e)。透射电镜观察，可见凋亡的颗粒细胞染色质固缩并凝结成块，聚集在核膜周边呈新月状或环状小体，细胞浆浓缩，内质网变疏松并与胞膜融合，形成一个个空泡；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图3A，B)。扫描电镜可见，凋亡细胞固缩变小，周围伸出的伪足减少甚至消失，细胞表面发泡，形成许多典型的凋亡小体(图3C，D)。

表1 不同培养天数的细胞计数

Table 1 The number of follicular granulosa cells counted in every day

时间/dTime012345678密度/(×104mL-1)Celldensity1.01.21.62.65.610.516.418.217.8

2.3 FSH对牦牛卵泡颗粒细胞凋亡及E2、P分泌的影响

卵泡颗粒细胞体外无血清培养体系中，添加0.050～5.000 IU·mL-1的FSH，培养24 h后，分别收集培养上清液和颗粒细胞，进行细胞凋亡和激素含量分析。FCM检测表明，随着FSH添加浓度的增加，凋亡细胞比例逐渐降低，在FSH添加浓度0.500 IU·mL-1时，凋亡细胞比例为11.8%，显著低于对照组的13.9%(P<0.05)，在添加浓度达到5.00 IU·mL-1时，凋亡细胞比例最低降到7.3%，与对照组差异极显著(P<0.01)。RIA分析培养上清液两种类固醇激素含量，结果表明，E2和P水平都随着添加FSH剂量的增加而呈上升趋势。其中，E2水平在FSH添加量为0.250 IU·mL-1时达到最高(2.94±0.03)pg·mL-1，与对照组(1.49±0.02) pg·mL-1差异极显著(P<0.01)。P水平在FSH添加量为0.500 IU·mL-1时达到最高(1.25±0.03)ng·mL-1，与对照组(0.59±0.03) ng·mL-1差异极显著(P<0.01)。随着FSH添加剂量的进一步增加，E2和P水平的升高都不明显(表2)。

2.4 LH对牦牛卵泡颗粒细胞凋亡及E2、P分泌的影响

FCM检测表明，在0.050～0.500 IU·mL-1，随着LH添加浓度的增加，凋亡细胞比例逐渐降低，在LH添加浓度0.500 IU·mL-1时，凋亡细胞比例为10.2%，显著低于对照组的14.1%(P<0.05)。随着LH添加浓度的进一步增加，凋亡细胞的比例开始升高，在添加浓度达到5.000 IU·mL-1时，凋亡细胞比例上升到24.2%，与对照组差异极显著(P<0.01)。RIA分析培养上清液两种类固醇激素含量，结果表明，E2和P水平都随着添加LH剂量的增加而呈上升趋势。E2水平在LH添加剂量为0.250 IU·mL-1时达到(2.01±0.13) pg·mL-1，显著高于对照组的(1.50±0.02) pg·mL-1(P<0.05)。P水平在FSH添加剂量为0.500 IU·mL-1时达到(1.20±0.05) ng·mL-1，极显著高于对照组的(0.58±0.03) ng·mL-1。随着LH添加剂量的进一步增加，E2和P水平的升高都不明显(表3)。

A.接种24 h 后，颗粒细胞呈典型的“星形”；B.接种48 h 后，颗粒细胞在聚集区域呈铺路石样贴壁生长；C.接种72 h 后，颗粒细胞铺满皿底；D.牦牛卵泡颗粒细胞体外培养的“S”型生长曲线A.Follicular granulosa cells show a distinctive stellate morphology after planting 24 h，B.Preconfluent monolayer of follicular granulosa cells after planting 48 h；C.Follicular granulosa cells after planting 72 h；D.Growth curves of yak follicular granulosa cells图1 体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞生长特征Fig.1 The growth characteristics of yak follicular granulosa cells cultured in vitro

a.正常卵泡颗粒细胞；b.凋亡早期细胞核浓缩、颜色变深；c.细胞核边集化；d.细胞核固缩、胞质高度浓缩；e.凋亡细胞裂解成凋亡小体a.Normal granulosa cell；b.Earlier apoptotic granulosa cell with condensed and darkened nuclear；c.Margination of nuclear chromatin；d.Nuclear pyknotic and cytoplasmic dehydration；e.Apoptotic bodies图2 体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞凋亡形态特征(瑞特氏染色，400×)Fig.2 Morphological characteristics of the apoptotic yak’s granulosa cells cultured in vitro (Wright’s stain，400×)

A、B.透射电镜观察，可见细胞核退形性变化，C、D.扫描电镜观察，可见细胞表面发泡和凋亡小体的形成A，B.The degradation of nuclear chromatin was observed under transmission electron microscope；C，D.The changes on cell’s surface was observed under scanning electron microscopy图3 体外培养牦牛卵泡颗粒细胞凋亡的超微形态Fig.3 Electron microscopy ultrastructural of the apoptotic yak’s granulosa cells cultured in vitro

表2 FSH对牦牛卵泡颗粒细胞凋亡和E2、P分泌的影响

Table 2 The effects of FSH to the apoptosis and E2，P secretion of yak granulosa cells culturedinvitro

FSH添加浓度/(IU·mL-1)FSHconcentration重复次数Times凋亡比例/%Apoptosisrate雌激素浓度/(pg·mL-1)E2concentration孕酮浓度/(ng·mL-1)Pconcentration5.00057.3±1.3b2.88±0.39b1.20±0.11b2.50059.3±1.4a2.71±0.27b1.09±0.02b0.500511.8±1.6a2.84±0.36b1.25±0.03b0.250513.1±1.72.94±0.03b1.03±0.13a0.125512.9±1.62.45±0.31a0.72±0.130.050513.9±1.51.83±0.130.61±0.10对照组Controlgroup513.9±1.11.49±0.020.59±0.03

a.与对照组差异显著(P<0.05)；b.与对照组差异极显著(P<0.01)。下同

a.P<0.05 (vs.control group)；b.P<0.01 (vs.control group).The same as below

表3 LH对牦牛卵泡颗粒细胞凋亡和E2、P分泌的影响

Table 3 The effects of LH to the apoptosis and E2，P Secretion of yak granulosa cells culturedinvitro

LH添加浓度/(IU·mL-1)LHconcentration重复次数Times凋亡比例/%Apoptosisrate雌激素浓度/(pg·mL-1)E2concentration孕酮浓度/(ng·mL-1)Pconcentration5.000524.2±3.1b2.36±0.06b1.21±0.00b2.500521.4±2.8b2.04±0.24a1.18±0.12b0.500510.2±1.3a2.01±0.11a1.20±0.05b0.250512.9±1.52.01±0.13a1.10±0.04a0.125513.2±1.71.90±0.201.05±0.05a0.050513.9±1.41.62±0.100.69±0.07对照组Controlgroup514.1±1.21.50±0.020.58±0.03

3 讨 论

3.1 卵泡颗粒细胞凋亡

颗粒细胞的体外培养为研究颗粒细胞本身的生物学特性、颗粒细胞与卵母细胞之间的相互作用提供了理想的模型，也为研究生殖激素对颗粒细胞生长发育的影响提供了有利的思路。早在20世纪70年代初，人们就开始研究大鼠卵泡颗粒细胞的体外培养方法。经过不断改进、完善，在包括人在内的多种哺乳动物上，都已有颗粒细胞体外培养的报道[7-8]。目前，颗粒细胞体外培养技术已成为研究生殖生理和内分泌等的重要手段。牦牛卵泡颗粒细胞体外培养的报道则鲜见报道。笔者利用屠宰场废弃的牦牛卵巢组织，建立了卵泡颗粒细胞体外培养模型，绘制了牦牛卵泡颗粒细胞体外培养条件下的生长曲线。在此基础上，观察牦牛卵泡颗粒细胞体外培养条件下发生细胞凋亡的显微和超微结构特征。为进一步研究牦牛卵泡颗粒细胞的生物学特性和在卵泡发育过程中的生理作用奠定了基础。

细胞凋亡是一种程序化的细胞自主死亡过程，在凋亡启动的不同阶段具有不同的生物化学变化和形态特征。A.Ali等[9]描述了牛卵巢优势卵泡中颗粒细胞凋亡的特征。发现随着凋亡的进行，颗粒细胞表现出染色质固缩，聚集于核膜下，呈界限分明的颗粒块状或新月形小体，细胞浆浓缩一直到凋亡小体形成等典型特征。J.P.Anchordoquy等[10-11]对体外培养的牛卵泡颗粒细胞采用地衣红染色后，观察到典型的凋亡特征。对体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞，采用瑞特氏染色后，在显微镜下也观察到核固缩、边集化、胞质浓缩以及凋亡小体形成等细胞凋亡的典型形态，通过电镜技术，也进一步证实颗粒细胞凋亡的发生。这一结果表明，瑞特氏染色法操作简便，可用于体外培养细胞的凋亡形态分析。

颗粒细胞凋亡不仅是导致卵泡闭锁的重要原因，也与卵母细胞的成熟及发育命运有关。E.Host等[12]研究表明颗粒细胞的凋亡与卵母细胞核的成熟、受精有关。R.S.Raman等[13]报道了卵子的受精能力与卵丘颗粒细胞的凋亡状态有关，K.S.Lee等[14]也报道卵丘颗粒细胞与患者的年龄、获卵数目、受精率及体外受精的结局有关，提示卵丘颗粒细胞的凋亡状态可以预测体外受精的结局。然而，E.Warzych等[15]对采用卵丘细胞凋亡指数预测卵母细胞减数分裂的能力提出了质疑。有关颗粒细胞凋亡在卵母细胞发育调控过程中的作用仍然是值得进一步研究的科学问题。牦牛卵泡颗粒细胞体外培养及凋亡检测体系，为研究牦牛颗粒细胞在卵泡发育及卵母细胞成熟调控过程中的作用及其机理提供了一个平台。

3.2 颗粒细胞凋亡的激素调控

颗粒细胞凋亡可由影响卵泡发育的各种因素和信号传导机制引发，也受旁分泌和自分泌及死亡基因和肿瘤基因之间的相互影响，尤其是FSH和LH可能是决定颗粒细胞命运的主要因素[16]。FSH能够提高哺乳动物卵巢颗粒细胞增殖活性。研究表明，FSH可能通过与其受体间的相互作用增加胰岛素样生长因子和类固醇激素水平，从而抑制颗粒细胞的凋亡，促使卵泡颗粒细胞的增殖[17-18]。李鹏飞等[19]在无血清体外培养条件下，研究了促卵泡素FSH和胰岛素对绵羊卵巢卵泡颗粒细胞增殖和雌激素分泌的影响。发现FSH与胰岛素的共培养体系，颗粒细胞的增殖和雌激素的分泌量显著高于单独处理组。当胰岛素浓度为10.0 ng·mL-1，FSH浓度为5.0 ng·mL-1时，颗粒细胞的生长状况最好，培养体系最佳，雌激素分泌量最高。这表明绵羊卵巢卵泡颗粒细胞增殖和雌激素分泌需在FSH诱导下进行；胰岛素对FSH诱导的绵羊卵巢卵泡颗粒细胞增殖和雌激素的分泌有促进作用。P.Lin等[20]也发现，胰岛素样生长因子-1可增强FSH对颗粒细胞产生雌、孕激素的作用，但其增强作用可被胰岛素样生长因子结合蛋白(Insulin-like growth factor binding protein，IGFBP)减弱。除蛋白水平调控外，新近研究表明，FSH可通过调节microRNA表达影响孕激素的合成和颗粒细胞凋亡[21]。J.M.Silva等[22]研究结果也证实，生理浓度的FSH单独或联合胰岛素均可刺激卵丘细胞分化和促进E2的合成能力。但在无血清培养条件下，过高浓度的FSH反而会降低卵丘细胞E2的合成能力，且高浓度的FSH还会产生异相作用，导致卵丘细胞黄体化[23]。本研究结果表明，在牦牛卵泡颗粒细胞体外培养系统中，添加0.125 IU·mL-1以上的FSH，就可显著提高颗粒细胞分泌E2的能力。当FSH添加剂量达到0.500 IU·mL-1时，颗粒细胞的凋亡比例也开始显著下降，分泌的E2和P浓度也极显著高于对照组。在FSH添加剂量达到5.000 IU·mL-1时颗粒细胞的凋亡比例极显著低于对照组。这一结果证实，在牦牛上FSH同样可以降低颗粒细胞凋亡比例，增强颗粒细胞分泌类固醇激素能力。

LH是垂体分泌的调节卵泡发育的另一种蛋白质激素，它是一种生物大分子，不能透过细胞膜，必须通过与位于靶细胞膜上的受体结合，把信息传递到细胞内，触发成熟卵泡排卵，促使卵泡向黄体转化[6]。王伟等[24]研究了LH对体外培养的猪卵巢颗粒细胞生长及类固醇分泌的影响。结果表明，高剂量的LH (4.0 IU·mL-1)有利于颗粒细胞由G0/G1期向S期转变，也能显著减少颗粒细胞E2和P4的分泌，并且LH对E2和P4的分泌的调节是通过改变这两种激素合成的关键酶芳香化酶(P450arom)和胆固醇侧链裂解酶(P450scc)的表达实现的。本研究在牦牛体外培养的卵泡颗粒细胞结果显示，在0.050～0.500 IU·mL-1，随着LH添加浓度的增加，凋亡细胞比例逐渐降低，而E2和P水平则呈上升趋势。当LH浓度达到5.000 IU·mL-1时，凋亡细胞的比例显著上升，而E2和P水平的升高不明显。这一结果表明，LH对牦牛牦牛卵泡颗粒细胞生长和功能发挥的调节具有剂量依耐性关系，低水平的LH可以促进颗粒细胞增殖和功能发挥，而高剂量的LH则促使颗粒细胞凋亡。

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(编辑 程金华)

The Effects of FSH，LH on Apoptosis and E2，P Secreting of Yak’s Granulosa Cells Culturedinvitro

XU Geng-quan1，FAN Jiang-feng1，2，YANG Shi-hua1，LI Gu-yue1，ZHAO Hua-shan1，YU Si-jiu1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China；2.TechnologicalResearchCenterofGansuProvinceforEmbryonicEngineeringofBovineandSheep&Goat，Lanzhou730070，China)

This experiment was conducted to study the effect of follicle stimulating hormone(FSH)，luteinizing hormone(LH) on apoptosis and steroids hormone secretion of yak’s granulosa cells culturedinvitro，reveal the mechanism of gonadotropin regulating follicle development.Invitroculture system was established and the growth characteristics，apoptotic morphology were observed using cell culture and micro examination technology.The effect of FSH，LH on apoptosis and estradiol (E2)，progesterone (P) secreting of yak’s granulosa cells culturedinvitrowas analyzed using flow cytometry (FCM) and radioimmunoassay (RIA).The results showed that：Cultured yak’s granulosa cells demonstrated typical epithelioid growth characteristic and had “S” shape growth curve.Occasionally，the apoptotic morphological characteristics such as nuclear pyknotic and margination，endoplasmic reticulum loosen can be found in the cell culture dishes.With the increase of FSH concentration from 0.050 to 5.000 IU·mL-1，the apoptotic rate decreased and the E2，P level be on the rise.When FSH reached 5.000 IU·mL-1，the apoptotic rate down to 7.3% which was very significantly from control group (P<0.01).The apoptosis of granulosa cells were inhibited and the E2，P secreting were prompted when LH was added in a small quantity (0.050-0.500 IU·mL-1)，on the other hand，high concentration of LH(5.000 IU·mL-1) prompted the apoptosis of granulosa cells and inconspicuously effected the E2，P secreting.These results indicated that FSH and LH played an important role in the regulation of follicle development and ovulation through adjust the apoptosis and steroids hormone secretion of granulosa cells in yak.

yak；gonadotropin；granulosa cell；apoptosis；hormone secretion

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.008

2014-10-30

国家自然科学基金面上项目(31272616)；甘肃省青年科技基金计划项目(1208RJYA081)

徐庚全(1963-)，男，甘肃武威人，研究员，博士，主要从事畜禽疾病诊断与防治研究，E-mail: xugq@gsau.edu.cn

*通信作者：余四九，教授， E-mail: yusj@gsau.edu.cn

S823.8+5；S814

A

0366-6964(2015)06-0932-08