鸦胆子油自微乳化颗粒急性毒性及协同抗肿瘤作用*

王春柳 龙凯花 杨 洁 辛永洁 李彤晖 李 晔

陕西省中医药研究院(西安 710003)

鸦胆子油自微乳化颗粒急性毒性及协同抗肿瘤作用*

王春柳 龙凯花 杨 洁 辛永洁 李彤晖 李 晔△

陕西省中医药研究院(西安 710003)

目的：鸦胆子油自微乳化颗粒急性毒性试验及其协同抗肿瘤作用研究。方法：以相当于14.4g鸦胆子油/kg剂量进行小鼠急性毒性试验，观察14d内小鼠毒性反应；考察鸦胆子油自微乳化颗粒1g鸦胆子油/kg剂量对环磷酰胺(CTX)和氟尿嘧啶(5-Fu)抗S180实体瘤的增效作用。结果：鸦胆子油自微乳化颗粒未测出LD50，在约576倍人体剂量下,连续观察14d，未观察到小鼠急性毒性反应；鸦胆子油自微乳化颗粒在相当于1g鸦胆子油/kg剂量下与环磷酰胺(CTX)、氟尿嘧啶(5-Fu)合用具有协同增效作用。结论：鸦胆子油自微乳化颗粒在所考察剂量下无明显急性毒性，具有与环磷酰胺(CTX)、氟尿嘧啶(5-Fu)协同抑瘤作用。

鸦胆子油是从苦木科植物鸦胆子干燥成熟果实中提取的脂肪油，现代药理学研究证明具有抗肿瘤作用[1]。鸦胆子油临床常用剂型鸦胆子油乳注射液、鸦胆子油口服乳剂存在稳定性差、不良反应大，有毒性等问题[2]。针对以上问题本课题组前期进行了鸦胆子油固体自微乳制剂开发研究，前期对该新型制剂的体外释放行为、质量标准、药代动力学性质、抗肿瘤作用进行了研究及报道[3-4]。本文对自制鸦胆子油自微乳化颗粒的安全性及协同抗肿瘤作用进行了研究与探讨，为鸦胆子油临床用药开发提供参考。

1 实验材料 1.1 实验动物 昆明种小鼠体重18～22g，雌雄各半，由第四军医大学实验动物中心提供[合格证号：NO 0022211，生产许可证号：SCXK(军)2007-007]。实验前饲养1周，选行为活动、饮食、精神状况正常的小鼠进行实验。

1.2 仪器与材料 电子天平(型号：BS210S，精确度：0.1mg)；普通光学显微镜(olympus )；显微镜(XSZ-D2，9818504)；恒温培养箱(Heraeus)；鸦胆子油自微乳颗粒剂为实验室自制(批号为：20120218，每袋30g，每袋含鸦胆子油0.5g)；注射用环磷酰胺(国药准字H32020857，批号11052821)；氟尿嘧啶注射液(国药准字H31020593，批号：110608)；人肺癌A549瘤株由中国医学科学院药物研究所引进，人民解放军第四军医大学实验动物中心提供。

2 实验方法 2.1 鸦胆子油自微乳化颗粒对小鼠的急性毒性试验研究 2.1.1 预试：自制鸦胆子油自微乳化颗粒人体服用剂量以鸦胆子油计为0.025g鸦胆子油/kg/d(人体重按60kg计)。试验时将鸦胆子油自微乳化颗粒配制成鸦胆子油自微乳，按照药液最大浓度进行灌胃预试。给药剂量(以鸦胆子油计，下同)为大剂量14.4g鸦胆子油/kg/d、中剂量7.2g鸦胆子油/kg/d、小剂量3.6g鸦胆子油/kg/d。取18～22g健康小鼠10只，给药前禁食12h，按0.4mL/10g的最大给药体积，24h内灌药3次，给药后观察小鼠一般情况，连续3d。

2.1.2 最大耐受量试验：取18～22g健康小鼠40只，随机分为正常对照组及给药组，每组各20只小鼠(雌雄各半)，给药前禁食12h，给药组按照14.4g鸦胆子油/kg/d剂量给药，以0.4mL/10g的灌胃体积在24h内灌胃3次，对照组给与同体积赋形剂，连续观察14d，详细记录小鼠行为活动、状态、饮食、大小便及毛色、分泌物等，末次给药后处死，进行尸检。

2.2 鸦胆子油自微乳剂对环磷酰胺(CTX)、氟尿嘧啶(5-Fu)抗S180实体瘤的增效作用 取昆明种小鼠60只，体重20±2g，雌性。在超净台内制备瘤细胞悬液，每只小鼠右腋皮下注射0.2mL，计瘤细胞数约为2.0×106瘤细胞。24h后随机分为6组，各组10只。模型组灌胃给予纯净水 20mL/kg；鸦胆子油自微乳颗粒组按照1g鸦胆子油/kg剂量灌胃；环磷酰胺组按照CTX 20mg/kg 灌胃；氟尿嘧啶组按照5-Fu 20mg/kg灌胃；鸦胆子油自微乳颗粒合环磷酰胺组按照 1g鸦胆子油/kg、CTX 20mg/kg灌胃 ；鸦胆子油自微乳颗粒、氟尿嘧啶组按照1g鸦胆子油/kg 、5-Fu 20mg/kg灌胃；以上剂量每日灌服1次，等容量20mL/kg。末次给药后第二天称体重、测瘤重、计算肿瘤抑制率，再根据nuebb氏分数成绩法计算试药加化疗药组的理论效应，当合并用药效应大于理论相加效应时，表示它们有协同作用。肿瘤抑制率=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%.nuebb氏分数成绩法：(fa)1.2=1-[1-(fa)1][1-(fa)2]，(fa)1和(fa)2分别为试药和化疗药的抑瘤率。

3 结 果 3.1 鸦胆子油自微乳化颗粒对小鼠的急性毒性试验研究 连续观察：3 d，小鼠大便正常，无死亡，活动自如，进食、饮水正常，也无明显中毒反应，未测出LD50，故选择14.4g鸦胆子油/kg剂量进行最大耐受量试验。给药后：小鼠大便正常呈湿润颗粒状，无死亡，活动自如，进食、饮水均正常，皮毛光洁，口、鼻、眼及肛门清洁无分泌物，两周内体重与对照组相比无显著性差异(P> 0.05)，结果见表1。解剖后胸腔、腹腔未见异常液体，肠管未见胀气，心、肝、脾、肺、肾等重要脏器未见颜色、形态异常，没有出血点或其它病理改变，胃黏膜颜色红润，无出血点或溃疡，尸检无异常。因此拟定鸦胆子油自微乳化颗粒剂小鼠最大受试药物量为：以鸦胆子油计14.4g鸦胆子油/kg，约为自拟临床用量的576倍。在此剂量下未观察到鸦胆子油自微乳的急性毒性反应。

表1 给药前后小鼠体重

3.2 鸦胆子油自微乳剂对环磷酰胺(CTX)、氟尿嘧啶(5-Fu)抗S180实体瘤的增效作用 结果见表2、表3，动物数始末相同，给药过程无死亡。由表2、表3结果可知，在实验过程中，给药组小鼠体重与模型组无显著差异；环磷酰胺(CTX)、氟尿嘧啶(5-Fu)及鸦胆子油自微乳化颗粒与环磷酰胺(CTX)或氟尿嘧啶(5-Fu)合用组小鼠瘤重与模型组相比，均显著降低(P< 0.01)。鸦胆子油自微乳剂1g鸦胆子油/kg剂量加CTX阈下量合并用药的抑制率53%大于理论相加效应50%，表明鸦胆子油自微乳剂与环磷酰胺有协同增效作用；鸦胆子油自微乳剂1g鸦胆子油/kg剂量加5-Fu阈下量合并用药的抑制率89%大于理论相加效应88%，表明鸦胆子油自微乳剂与氟尿嘧啶有协同增效作用。

表2 鸦胆子油自微乳剂对环磷酰胺(CTX)抗S180肉瘤的增效作用

注：与模型组比较 ，△P< 0.01

表3 鸦胆子油自微乳剂对氟尿嘧啶(5-Fu)抗S180肉瘤的增效作用

注：与模型组比较，△P<0.01

4 讨 论 有报道鸦胆子油乳注射液为LD50为6.25g/kg，另有研制鸦胆子油亚纳米乳注射液，其LD50为7.388g/kg[5]。本课题组研制的鸦胆子油自微乳颗粒在14.4g /kg(以鸦胆子油计)即约576倍人体剂量下无明显急性毒性反应，未测出LD50，说明其安全性较文献报道剂型有所提高。本课题组前期研究表明鸦胆子油自微乳化颗粒在体外生物利用度较口服乳剂高，鸦胆子油自微乳在体外能够显著抑制肺癌A549细胞的增值[6-7]。本文研究证明鸦胆子油自微乳化颗粒的安全性较高，且与环磷酰胺(CTX)及氟尿嘧啶(5-Fu)均具有协同抗肿瘤作用。以上研究结果可为鸦胆子油自微乳化颗粒后续研究乃至临床研究奠定基础。

[1] 张凌云. 鸦胆子与混伪品的鉴别[J].陕西中医,2012,33(5):612-613.

[2] 谢秋红. 1例鸦胆子油乳注射液引起速发型过敏反应救护体会[J].中国老年保健医学,2011,9(3):102.

[3] 马海萍,戴学栋,戴晓莉，等. 鸦胆子油乳注射液大鼠长期毒性实验研究[J].中国药物警戒,2013,10(6):330-333.

[4] 蒋 楠,李 晔,陈 钢，等. 鸦胆子油自微乳的制备及溶出度考察[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(9):45-48.

[5] 李彤晖,李 晔,陈 钢,等. 鸦胆子油自微乳化颗粒质量控制方法研究[J].中国实验方剂学杂志2014,20(8):89-92.

[6] 李 晔,孙 雯,蒋 楠，等. 鸦胆子油自微乳化颗粒大鼠体内生物利用度考察[J].中成药,2014,36(12):2615-2617.

[7] 杨 洁,赵林涛,李 凡，等. 鸦胆子油自微乳剂对肺癌A549细胞增殖的抑制作用[J].第二军医大学学报,2012,33(8):928-930.

(收稿2015-07-29；修回2015-08-25)

抗肿瘤药 鸦胆子

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.12.058

*陕西省“13115”科技创新工程重大科技专项(2009ZDKG-82)

△通讯作者