康妇炎胶囊对兔盆腔炎性疾病后遗症模型粘连相关指标影响的实验研究*

蔡 竞 贺丰杰 朱虹丽 孙 康 刘 霞

陕西中医药大学附属医院妇科(咸阳712000)

康妇炎胶囊对兔盆腔炎性疾病后遗症模型粘连相关指标影响的实验研究*

蔡 竞 贺丰杰 朱虹丽 孙 康 刘 霞

陕西中医药大学附属医院妇科(咸阳712000)

目的： 通过观察康妇炎胶囊对盆腔炎性疾病(PID)后遗症模型兔子宫、输卵管组织粘连相关指标细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-a)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响，从抗粘连方面探讨康妇炎胶囊治疗盆腔炎性疾病后遗症的机制。方法： 将5～6个月龄新西兰雌兔分为：正常组、模型组、桂枝茯苓组、康妇炎组，除正常组外，其余3组均通过逆行宫腔插管灌注细菌法建立盆腔炎模型，造模成功后，模型组、桂枝茯苓组、康妇炎组分别灌服蒸馏水、桂枝茯苓胶囊、康妇炎胶囊3周，正常组灌服蒸馏水。肉眼观察各组兔子宫及输卵管情况；HE染色观察各组兔子宫、输卵管组织学变化；免疫组化及免疫印迹法检测各组兔子宫、输卵管组织ICAM-1、 TNF-a、VEGF表达的变化。结果：肉眼观察模型组兔腹膜明显增厚，盆腔积液，子宫充血，质脆，弹性差，输卵管管壁粗糙、增厚，与周围组织粘连，或外观略呈串珠样；康妇炎组兔腹膜增厚不明显，无盆腔积液，子宫无明显充血，输卵管与周围组织无明显粘连；康妇炎组兔子宫、输卵管组织ICAM-1、 TNF-a、VEGF表达较模型组明显降低(P<0.05 或P<0.01)。结论：康妇炎胶囊治疗PID后遗症可能与其降调子宫、输卵管组织粘连相关指标ICAM-1、TNF-α、VEGF的表达有关。

盆腔炎性疾病 (Pelvic inflammatory disease,PID) 后遗症是因盆腔炎性疾病未及时治疗或治疗不当,病程迁延而致。其病理表现以组织破坏、粘连、增生、瘢痕形成为主,患者临床症状主要表现为反复下腹疼痛或下腹坠胀感、腰骶酸痛、白带异常等,远期可出现不孕、异位任娠及慢性盆腔痛、盆腔炎性疾病反复发作等，严重降低了妇女的生活质量。本研究复制前期实验建立的PID后遗症兔模型[1]，通过观察康妇炎胶囊对模型兔盆腔组织ICAM-1、TNF-α、VEGF粘连相关指标的影响，从抗粘连方面探讨康妇炎胶囊对PID后遗症治疗作用的机制，为其临床治疗本病提供可靠的实验室依据。

1 实验动物 5～6 个月龄健康新西兰雌兔36只，性成熟，未交配。购自西安交通大学实验动物中心，合格证号：医动字第08-018。饲养环境：陕西中医学院中药药理实验室，动物分笼饲养，保持12h昼夜节律，室温(22±1)℃，自由饮水摄食。

2 药品及试剂 康妇炎胶囊(山东步长神州制药有限公司，批号131118。成分为蒲公英、败酱草、薏苡仁、赤芍、苍术、当归、川芎、香附、延胡索(制)、泽泻、白花蛇舌草，0.4g/粒，48粒/盒)、桂枝茯苓胶囊(江苏康缘药业股份有限公司，批号130907，成分桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍，0.31g/粒，10粒/盒)、细胞粘附分子(ICAM - 1)抗体(批号：bs-4615R)、转化生长因子-α(TNF-α)抗体(批号：bs-2081R)、血管内皮生长因子(VEGF)抗体(批号：bs-1665R)，均购自博奥森公司。

3 实验方法 3.1 菌液制备 于实验前1 h，将大肠埃希菌标准株加金黄色葡萄球菌标准菌株的肉汤增菌液稀释为 1×107/L 浓度菌液[2]。

3.2 造模方法 实验前 6 h，每只兔肌内注射孕马血清50 IU。宫腔插管灌注细菌：兔固定暴露外阴后，将长约 12 cm、直径约1mm 的一次性无菌橡胶管插入兔阴道内约 7～8 cm；回抽顺利无液体，证明插管顺利进入宫腔。经插管注入混合菌液(1 mL/kg)，观察 30 s，无液体外溢，将兔倒置 3 min 后放回饲养笼[2]，第49天静脉麻醉后行剖腹探查术 1 次，观察盆腔脏器外观变化，当观察到所有动物子宫充血、质脆，输卵管管壁粗糙、增厚，与周围组织粘连，或外观略呈串珠样改变时确定造模成功，常规关腹。

3.3 分 组 实验兔按体质量用SPSS13.0统计软件完全随机法随机分为正常组、模型组、桂枝茯苓组、康妇炎组，每组9只。除正常组外其余3组均造模，造模成功后模型组、桂枝茯苓组、康妇炎组分别灌服蒸馏水、桂枝茯苓胶囊、康妇炎胶囊3周，正常组灌服蒸馏水。各组用药剂量根据临床人用剂量换算家兔给药量，具体如下：正常组和模型组予蒸馏水5mL/只灌胃，1d1次；桂枝茯苓组：桂枝茯苓胶囊溶于温开水中，以0.12g/kg灌胃，1d1次；康妇炎组：康妇炎胶囊溶于温开水中，以0.154g/kg灌胃，1d1次；以上各组均于造模成功后给药，连续给药3周。

3.4 观察盆腔脏器变化及标本采集 给药3周后，次日清晨戊巴比妥钠耳静脉麻醉，剖腹探查观察盆腔脏器变化，处死，摘取子宫及双侧输卵管，精密称量，

将子宫从正中间切开，一半放入10%中性甲醛溶液中固定备HE染色及免疫组化(S-P)法检测用；另一半置入液氮罐中保存备免疫印迹法检测用。

3.5 HE染色观察各组兔子宫及输卵管组织形态学变化 组织经10%中性甲醛溶液浸泡，石蜡包埋，切片，常规二甲苯透明，酒精梯度脱水，苏木精-伊红染色法(HE)常规染色，显微镜下观察。

3.6 免疫组化S-P法检测各组兔子宫、输卵管组织中ICAM-1、 TNF-α、VEGF的表达 组织经10% 中性甲醛溶液48h充分固定后，石蜡包埋，切片，二甲苯透明，梯度酒精脱水，进行ICAM-1、 TNF-a、VEGF免疫组织化学染色。每组每张切片在200倍的光学显微镜下，选取每只大鼠免疫组化染色切片面积大致相同的 5 个视野，BI-2000医学图像分析系统分析各张切片的灰度值，取5个视野平均值作为该切片最后结果。

3.7 免疫印迹法检测各组兔子宫、输卵管组织中ICAM、TNF-α、VEGF的表达 将组织标本剪碎，提蛋白并测定蛋白浓度， SDS-PAGE电泳，转膜，膜封闭，一抗、二抗孵育，显色，曝光于X胶片上，常规显影、定影。内参照为鼠抗人GAPDH单抗(1：5000)。结果经图像分析软件处理，得出相对灰度值。

4 结 果 4.1 各组兔子宫及输卵管组织形态学变化

4.1.1 肉眼观察兔盆腔：正常组腹膜正常，子宫、输卵管形态、色泽正常，组织坚韧，与周围组织无粘连；模型组腹膜增厚，盆腔有积液，子宫充血，质脆，弹性差；输卵管管壁粗糙、增厚，与周围组织粘连，或外观略呈串珠样。桂枝茯苓组腹膜轻度增厚，无盆腔积液，子宫轻度充血，弹性差；输卵管管壁粗糙，轻度增厚，部分与周围组织粘连。康妇炎组腹膜增厚不明显，无盆腔积液，子宫充血不明显，弹性可；输卵管管壁光滑，无增厚，与周围组织无粘连。

4.1.2 镜下情况：正常组子宫壁结构整齐，腺体结构清晰；输卵管血管无扩张，无淋巴细胞聚集。模型组子宫壁组织结构紊乱，腺体明显减少，灶状淋巴细胞聚集，多量浆细胞；输卵管血管扩张明显，散在淋巴细胞浸润。桂枝茯苓组输卵管间质内灶状淋巴细胞。康妇炎组子宫壁结构基本接近正常，腺体增多，少量浆细胞；输卵管扩张不明显，少量淋巴细胞，炎症不明显。见图1。

4.2 各组兔子宫、输卵管组织中ICAM-1、 TNF-α、VEGF表达比较 4.2.1 各组兔子宫、输卵管组织中ICAM-1表达比较:两种检测方法显示：与正常组比较，模型组兔子宫、输卵管组织ICAM-1表达均增多(P<0.01)；与模型组比较， 康妇炎组组兔子宫、输卵管组织 ICAM-1表达均降低(P<0.01)，桂枝茯苓组略有降低，但无统计学意义；与桂枝茯苓组比较，康妇炎组兔子宫、输卵管组织 ICAM-1均降低(P<0.01)。说明康妇炎胶囊降调ICAM-1的效果优于桂枝茯苓胶囊。结果见表1。

表1 各组兔子宫、输卵管组织ICAM-1表达比较

注：与正常组比较 △P<0.05， ▲P<0.01；与模型组比较 ◇P<0.05， ◆P<0.01 ；与桂枝茯苓组比较□P<0.05,■P<0.01

4.2.2 各组兔子宫、输卵管组织中TNF-α表达比较：两种检测方法显示：与正常组比较，模型组兔子宫、输卵管组织TNF-α表达均增多(P<0.01)；与模型组比较， 康妇炎组兔子宫、输卵管组织TNF-α表达均降低(P<0.01)，桂枝茯苓组免疫印迹法降低(P<0.01)；与桂枝茯苓组比较，康妇炎组兔子宫、输卵管组织TNF-α均降低(P<0.05)。说明康妇炎胶囊降调TNF-α的效果优于桂枝茯苓胶囊。结果见表2。

表2 各组兔子宫、输卵管组织TNF-α表达比较

注：与正常组比较 △P<0.05， ▲P<0.01；与模型组比较 ◇P<0.05， ◆P<0.01 ；与桂枝茯苓组比较□P<0.05,■P<0.01

4.2.3 各组兔子宫、输卵管组织中VEGF表达比较:两种检测方法显示：与正常组比较，模型组兔子宫、输卵管组织VEGF表达均增多(P<0.01)；与模型组比较， 康妇炎组、桂枝茯苓组兔子宫、输卵管组织VEGF表达均降低(P<0.01)；与桂枝茯苓组比较，康妇炎组兔子宫、输卵管组织VEGF均降低(P<0.05或P<0.01)。说明康妇炎胶囊降调VEGF的效果优于桂枝茯苓胶囊。结果见表3。

表3 组兔子宫、输卵管组织VEGF表达比较

注：与正常组比较 △P<0.05， ▲P<0.01；与模型组比较 ◇P<0.05， ◆P<0.01 ；与桂枝茯苓组比较□P<0.05,■P<0.01

5 讨 论 盆腔炎性疾病后遗症是盆腔感染后期持续存在的慢性炎症状态，以局部广泛纤维化为特征。细胞间粘附分子-1(ICAM-l) 在慢性炎症中,诱导了组织损伤及局部组织慢性纤维化过程，如果 ICAM-1 的表达被下调、被抑制，则炎症反应将减轻，故减轻组织中ICAM-1的表达在阻断、减轻炎症及瘢痕形成中起重要作用[2]。肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α))是一种具有细胞毒性作用及诱导炎性细胞释放毒性物质的作用细胞毒细胞因子,可刺激成纤维细胞增生、促进胶原酶释放等作用参与组织损伤过程[3]，盆腔炎性疾病患者腹腔液及血清TNF-α与盆腔粘连呈显著性相关，局部TNF-α越高，盆腔局部粘连越重[4]。因此，TNF-α也被称为腹腔内粘连形成标志物。血管内皮生长因子(VEGF)又名血管通透因子(Vascular permeability factor，VPF)，不同程度的表达于人体的多个组织中，炎性细胞能促进 VEGF 的形成，而 VEGF 的高表达，促使粘连组织中的新生毛细血管增多，降低VEGF的表达能够抑制毛细血管的新生，可减少供给粘连组织的营养物质和氧，从而减少粘连的形成。

盆腔炎性疾病后遗症患者由于盆腔长期受慢性炎症刺激，周围组织增厚、粘连，抗生素难以进入病变部位，因此目前现代医学对此无理想的治疗方法。大量的临床报道及实验研究表明中医药对该病有确切的疗效[5-8]。中药康妇炎胶囊由蒲公英、败酱草、薏苡仁、赤芍、苍术、当归、川芎、香附、延胡索、泽泻、白花蛇舌草等组成,其中蒲公英、败酱草、白花蛇舌草清热解毒；苍术、薏苡仁健脾利湿，清热排脓；香附、延胡索疏肝理气止痛；当归、川芎、赤芍祛瘀养血止痛；泽泻利水渗湿。诸药相配，具有清热解毒、化瘀止痛之功效。本实验研究结果表明康妇炎胶囊可明显改善PID后遗症模型兔盆腔粘连状态，推测其疗效机制，可能是通过降低子宫、输卵管组织粘连因子ICAM-1、TNF-α、VEGF的表达，减轻盆腔组织水肿、炎性渗出及粘连，控制盆腔炎性疾病的病理发展，促使盆腔炎症逐渐愈合，且疗效优于桂枝茯苓胶囊。

[1] 李俊良,刘 恒,王建六,等.兔盆腔炎性疾病后遗症模型的制备[J].国际妇产科学杂志,2011,38(6):517-519.

[2] 宗 惠.活血补肾法调控慢性盆腔炎大鼠炎症细胞因子及粘连相关指标的实验研究[J]. 山东中医药大学博士论文,2014.

[3] 陶莉莉,陈小平,傅艳红,等.腹腔镜术后中药治疗对盆腔炎性不孕患者肿瘤坏死因子-α、白细胞介素- 6 的影响[J].广州中医药大学学报,2012,29(3):227-230.

[4] 陈小平,陈靓芬,陶莉莉.中药联合腹腔镜对盆腔炎性不孕患者肿瘤坏死因子α的影响[J].云南中医中药杂志,2013,34(6):16-19.

[5] 张瑞雪.康妇炎胶囊联合保妇康栓治疗慢性盆腔炎的临床疗效分析[J].医学综述,2014,20(15):2857-2858.

[6] 刘开敏,张开红.康妇炎胶囊、血府逐癖胶囊联合抗生素治疗盆腔炎性疾病后遗症的疗效观察[J].中国医药指南,2013,11(34):315-316.

[7] 刘 琰.康妇炎胶囊治疗慢性盆腔炎疗效观察[J].临床合理用药,2014,7(3):63-64.

[8] 曾 维,罗学宏,王小刚.康妇炎胶囊联合保留灌肠治疗盆腔炎65例[J].陕西中医,2014,35(3):276-277.

(收稿2015-06-22；修回2015-08-03)

Experimental research on the effects of Kangfuyan capsule on adhesion-related indices in the rabbits with sequelae of pelvic inflammatory disease

Cai Jing He Fengjie Zhu Hongli et al

Affiliated Hospital of Shannxi College of TCM (Xianyang 712000)

Objective: To investigate the mechanism of Kangfuyan capsule treating sequelae pelvic inflammatory disease (PID) by observing the effect of Kangfuyan capsule on adhesion related indexs ICAM-l,TNF-α,VEGF in uterus and fallopian tube of rabbits with sequelae of PID. Method: New Zealand female rabbits with 5 ～ 6 month age were divided into normal group, model group, Guizhifuling capsule group, Kangfuyan capsule group . Except the normal group ,rabbits in other 3 groups were all established the sequelae of PID model by injecting mixture of bacterial suspension into rabbits uterus. Model group, Guizhifuling capsule group ,Kangfuyan capsule group were given distilled water, Guizhifuling capsule, Kangfuyan capsule for 3 weeks respectively after the sequelae of PID models established successfully. The normal group also were given distilled water for 3 weeks. We observed the pelvic,uterus,fallopian tubes situationg of all the rabbits with our naked eyes. HE staining to observe uterus, fallopian tubes pathological changes. Using immunohistochemistry method and western blot to detect the expression of the following indices in uterus and fallopian tubes of rats: ICAM-l,TNF-αand VEGF . Results: In the model group,peritoneal was thickened clearly,pelvic fluid was formed.Uterus were bloodshot,brittle and low elasticity.Fallopian tube walls were rough,thickened, had some adhesion with adjacent tissue,and showed string-of-beads pattern.In Kangfuyan capsule group, peritoneal was not markedly thickened,no pelvic fluid was found, uterus were no congestion, fallopian tubes were no adherence with surround-tissue. Compared with model group expression of ICAM-l,TNF-αand VEGF of Kangfuyan capsule group decreased significantly(P<0.05 orP<0.01). Conclusions : The mechanism of Kangfuyan capsule treating sequelae of PID might be related to that Kangfuyan capsule down regulating the expression of ICAM-l,TNF-αand VEGF in model rabbits.

Pelvic inflammatory disease/ traditional Chinese medicine therapy Animal experimentation Rabbits @Kangfuyan capsule Intercellular adhesion molecule-1 Tumor necrosis factor-alpha Vascular endothelial growth factors

*陕西省教育厅项目(14JK1198)

盆腔炎性疾病/中医药疗法 动物实验 兔 @康妇炎胶囊 胞间粘附分子1 肿瘤坏死因子-α 血管内皮生长因子

R711.33

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.11.048