Tempol预处理对七氟醚麻醉下老龄大鼠术后认知功能的影响

西安市红会医院麻醉科(西安710054)

苏 晗 张 洁

Tempol预处理对七氟醚麻醉下老龄大鼠术后认知功能的影响

西安市红会医院麻醉科(西安710054)

苏 晗 张 洁

目的：探讨Tempol对七氟醚麻醉下老龄大鼠术后认知功能的影响。方法：老龄雄性SD大鼠32只，体重500～600g，20月龄，采用随机数字表法,分为4组(n=8)：正常对照组(C组)，Tempol预处理组(T组)，七氟醚组(S组)和七氟醚+Tempol组(ST组)。T组和ST组连续3d腹腔注射Tempol 100mg/kg,C组和S组相应给予腹腔注射等容量0.9%生理盐水,S组和ST组大鼠分别给予连续3d,每天1次,1次4h的七氟醚麻醉,C组和T组仅置于麻醉箱内对照,不进行七氟醚麻醉，采用Morris水迷宫对各组大鼠进行认知功能测定。完成水迷宫行为学测试后,随机处死4只大鼠采用高尔基染色方进行海马树突棘密度测定，剩余4只大鼠处死后采用 ELISA法测定海马内丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量。结果：与C组相比，S组和ST组大鼠游泳路程和逃避潜伏期延长,穿越平台次数和平台所在象限停留时间缩短(P< 0.05)；与S组相比，ST组大鼠游泳路程和逃避潜伏期缩短,穿越平台次数和平台所在象限停留时间增加(P<0.05)。与C组相比，S组海马内MDA含量升高,SOD含量和树突棘密度下降(P< 0.05)。与S组相比，ST组海马内MDA含量下降，SOD含量和树突棘密度升高(P<0.05)。C组和T组大鼠海内马MDA和SOD含量及神经元树突棘密度变化无统计学差异(P>0.05)。结论：Tempol预处理可缓解七氟醚麻醉所引起的老龄大鼠术后认知功能障碍，其机制可能与Tempol抑制氧化应激反应及增加其海马内树突棘密度有关。

术后认知功能障碍(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)是指术前无认知功能障碍的病人，在麻醉及手术后出现焦虑、记忆受损、语言理解能力和社会融合能力减退为主的并发症,其中老年患者为易发人群[1]。有研究证实七氟醚可引起老年人术后认知功能障碍,促进淀粉样蛋白β的寡聚化和纤维体形成，从而抑制认知功能[2-3],其机制在于七氟醚可激活内皮细胞钙依赖蛋白酶产生大量氧自由基,从而诱发海马神经元脂质过氧化损伤[4]。Tempol(1-氧-4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶)作为新型自由基清除剂,具有分子量小,稳定性强及细胞膜通透性好等优点,可清除自由基，抑制脂质过氧化，抑制神经细胞的氧化损伤[5]。有研究表明Tempol预处理来改变脑组织的氧化环境，对缺血缺氧损伤的脑组织神经功能的恢复具有保护作用[6]。本研究旨在探讨Tempol对七氟醚麻醉下老龄大鼠术后认知功能的影响，为研究POCD的防治提供可能的理论依据。

材料与方法

1 动物选择及分组 健康清洁级老龄雄性SD大鼠32只,体重500～600g,20月龄,采用随机数字表法,将其分为4组(n=8)：正常对照组(C组),Tempol预处理组(T组),七氟醚组(S组)和七氟醚+Tempol组(ST组)。

2 Tempol预处理及七氟醚麻醉 T组和ST组连续3d腹腔注射Tempol(Sigma公司,美国) 100mg/kg,C组和S组相应给予腹腔注射等容量0.9%生理盐水(Baxter制药公司)；腹腔注射后将S组和ST组大鼠置于自制麻醉箱(50cm×30cm×30cm)进行七氟醚麻醉，箱底铺钠石灰，麻醉箱放于37℃恒温水浴箱内。麻醉箱有两个通气孔,上孔连接麻醉机,用于通入七氟醚(雅培公司，美国)，氧流量2L/min,氧浓度50%，下孔位于对侧，连接Ohmeda麻醉气体监测仪(Datex- Ohmeda公司，芬兰)监测MAC值维持在2.0MAC。S组和ST组大鼠分别给予连续3d，每天1次，1次4h的七氟醚麻醉,C组和T组仅置于麻醉箱内对照,不进行七氟醚麻醉。常规监测心率、血压和脉搏血氧饱和度。发生脉搏血氧饱和度低于95%或平均动脉压下降幅度超过基础值的20%者从研究中剔除。

3 大鼠认知功能的测定 参考文献[7]的方法在完成七氟醚麻醉后1d开始对各组大鼠进行认知功能测定。采用ZH0065型Morris水迷宫系统测定认知功能，持续5d，前4d进行定位航行实验，第5天进行空间探索实验，实验均于上午9点开始，维持水温23℃。将各组大鼠从一个固定入水点面向池壁置入水中，记录120s内寻找平台的时间为逃避潜伏期，让其在平台上停留30s。若120s内未能找到将其引上平台停留30s。于第5天撤去隐匿于水中的平台，将子代大鼠从固定点放入水中，记录120s内大鼠游过前期放置平台所在象限的次数(穿越平台次数)及其在平台所在象限的停留时间(平台所在象限停留时间)。整个测试过程中，保证实验室内灯光和物品摆放等室内环境一致，以排除环境干扰。

4 大鼠海马内MDA和SOD含量的测定 各组大鼠完成水迷宫行为学测试后，随机取4只进行迅速断头处死后于冰台上分离海马，参考文献[8]采用 ELISA方法测定海马内MDA和SOD的含量，按25ml·g-1加入相当体积的冰生理盐水，匀浆器研磨组织，冰浴下超声波粉碎制成匀浆，4℃离心后取上清液。按ELISA测定试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)说明书步骤进行操作对海马内MDA和SOD的含量进行测定。采用NK3酶标仪 (Ladsystems公司，芬兰)，测定吸光度OD值的波长为490nm，96孔培养板，对应标准曲线，得出MDA和SOD的含量。

5 大鼠海马树突棘密度的测定 各组剩余4只大鼠海马树突棘密度测定。采用腹腔内注射10%水合氯醛350mg/kg麻醉后，进行快速灌注Golgi染色。0.5%亚硝酸钠液快速灌注后用4%多聚甲醛固定1h。随后媒体液(5%水合氯醛+5%重铬酸钾+10%甲醛混合液)慢速灌注，至流出浓厚橘红色液。开颅取出大脑半球，从前中1/3处向后取组织块，修块后将其浸泡于媒染液中，置于37℃温箱内24h,用1%硝酸银染色浸泡镀银后，置于37℃温箱内3d,更换镀银液1次/d。冰冻切片机连续切片，厚度100μm，切片经2%重铬酸钾溶液及蒸馏水漂洗，依次脱水、透明、封片。在光镜下进行采图。在每只大鼠的背侧海马水平CAl进行树突棘密度分析，随机选择10个的椎体细胞，观察其第二级顶树突，以每10μm为计数单位，每个细胞观察3支分支。于LEICA显微镜×1000油镜下进行采图计数，最终数据以每10μm长度的树突棘个数为表现。

结 果

1 大鼠生理指标变化 各组大鼠在麻醉处理过程中血氧饱和度均>95%，心率及平均动脉压与其基础值比较无差异，呼吸均匀，肤色红润，血糖均维持在正常范围内。

2 大鼠水迷宫行为学指标变化 见表1。与C组相比，S组和ST组大鼠游泳路程和逃避潜伏期延长，穿越平台次数和平台所在象限停留时间缩短(P< 0.05)。与S组相比，ST组大鼠游泳路程和逃避潜伏期缩短，穿越平台次数和平台所在象限停留时间增加(P<0.05)。C组和T组大鼠水迷宫行为学指标变化指标比较无统计学差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠水迷宫行为学指标变化的比较

注：与C组比较，aP<0.05；与S组比较，bP<0.05

3 大鼠海内马MDA和SOD含量及神经元树突棘密度变化 见表2。与C组相比，S组海马内MDA含量升高，SOD含量和树突棘密度下降(P< 0.05)。与S组相比，ST组海马内MDA含量下降，SOD含量和树突棘密度升高(P<0.05)。C组和T组大鼠海内马MDA和SOD含量及神经元树突棘密度变化无统计学差异(P>0.05)。

表2 大鼠海内马MDA和SOD含量及神经元树突棘密度变化的比较

注：与C组比较，aP<0.05；与S组比较，bP<0.05

讨 论

本研究的实验模型是选用易在麻醉后出现POCD老年大鼠作为对象，并在浓度较高的七氟醚进行长时间多次麻醉后，检测水迷宫行为学证实出现了POCD,从而探讨Tempol的保护作用及机制。各组大鼠麻醉期间生理指标均在正常范围内,无低血糖发生,排除了生理性干扰对其影响。

七氟醚以其起效快、排出快，肌松效果良好，麻醉效果确切，对循环和呼吸功能抑制轻等特点，广泛应用于老年患者的临床麻醉中。研究表明七氟醚能通过促进脑内β淀粉样单体寡聚化的作用引起海马内tau蛋白过度磷酸化，使其丧失生理功能，引起POCD[9]，同时，七氟醚亦可激活内皮细胞钙依赖蛋白酶产生大量氧自由基[5]。突触可塑性障碍均可导致认识功能障碍，树突表面的树突棘是形成突触的具体位点，在神经元信息传递和加工中起至关重要的作用[10]，七氟醚可抑制突触后膜乙酰胆碱突触的传递，从而抑制了突触可塑性[11]。本研究结果显示单纯七氟醚麻醉组麻醉后出现严重的认知功能障碍，海马内MDA含量升高且树突棘密度减少，与前人研究结果一致。

Tempol是的SOD拟似物，具有分子量小，稳定性强，细胞膜通透性好等特点，对脊髓，肝脏，肾脏的缺血再灌注损伤具有保护作用[12]。本研究证实给予Tempol预处理后大鼠的学习记忆能力明显改善，说明抗氧化剂Tempol能够改善七氟醚所致POCD大鼠的学习记忆能力。此外，由于七氟醚所致POCD特征性病理改变之一是海马内氧化应激损伤和树突棘减少，因此我们检测了氧化应激损伤和保护的标志物MDA和SOD以及树突棘密度的变化。我们的实验结果显示给予Tempol预处理能够明显改善大鼠七氟醚所致的氧化应激损伤而提高保护性物质SOD的含量，并增加神经元树突棘密度。因此，我们推测Tempol可能通过对抗了氧化应激损伤及增加树突棘密度，从而改善了大鼠的学习记忆能力，产生治疗七氟醚麻醉下老龄大鼠术后认知功能的效果。

综上所述，Tempol预处理可缓解七氟醚麻醉所引起的老龄大鼠POCD，其机制可能与Tempol抑制氧化应激反应及增加其海马内树突棘密度有关。

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(收稿：2014-09-17)

甲醚类 麻醉 认知障碍 氧化性应激 树突棘 自由基清除剂 @ Tempol

R614.2

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10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.008