电针足三里对AD小鼠大脑皮层APP和Aβ表达的影响*

李 翀 韩燕燕 樊小农

天津中医药大学(天津300193)

电针足三里对AD小鼠大脑皮层APP和Aβ表达的影响*

李 翀∆韩燕燕∆樊小农▲

天津中医药大学(天津300193)

目的:探究电针足三里对老年痴呆小鼠大脑皮层β-淀粉样肽前体蛋白(APP)及β-淀粉样肽蛋白(Aβ)表达的影响。方法: 将快速老化小鼠SAMP8随机分为模型组、电针组和非穴组，并设同源SAMR1小鼠作为对照组。电针组给予足三里电针干预，非穴组针刺双侧固定非穴位点。应用免疫组织化学SABC法观察各组小鼠大脑皮层APP及Aβ的表达情况。结果:SAMP8大脑皮层内APP和Aβ蛋白呈较高表达的状态，电针治疗后明显下调，与模型组、非穴组相比，差异有统计学意义(P<0.01)；而非穴组与模型组相比，各指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:电针足三里能有效改善AD，其机制可能与其下调AD小鼠大脑皮层APP及Aβ蛋白水平的表达有关。

阿尔兹海默病(AD)即老年性痴呆，统计资料显示我国目前有老年性痴呆患者约500万，到2020年患病人数将超过600万，并以每年三四十万人的数量增长，给家庭和社会带来沉重的负担和危害[1-3]。现代医学对其尚缺乏理想的治疗手段，而中医针灸却有其独到之处。

目前有关针灸治疗阿尔兹海默病的研究虽然取得了可观的进展，但针灸是如何对AD发挥其治疗作用的，尚未达成共识。多项研究表明：电针多个穴位对AD有较好的疗效[4-6]，但其最佳组方目前尚不统一。疗效可靠、作用机制明确的单穴位针灸治疗AD鲜见报道。本研究选取快速老化小鼠SAMP8为研究对象，以SAMR1小鼠为对照，观察电针足三里对SAMP8鼠大脑皮层β-淀粉样肽前体蛋白APP及Aβ表达水平的影响，以探讨电针足三里延缓AD进程的可能作用机制。

1 实验材料 雄性快速老化小鼠亚系(Senescence-accelerated mouse prone/8，SAMP8)，6月龄，清洁级，共18只。健康同月龄抗快速老化小鼠亚系(Senescence-accelerated mouse resistancel/1，SAMR1)，清洁级，共6只。所有小鼠均由天津中医药大学第一附属医院动物中心提供。

APP及Aβ兔抗大鼠一抗试剂盒、SABC山羊抗兔二抗试剂盒及DAB显色剂(北京中杉试剂有限公司)； 图像分析系统(同济医科大学千屏影像工程公司)。

2 实验方法 2.1 分 组 将18只SAMP8小鼠随机分为3组：模型组、电针组和非穴组，每组6只。同源SAMR1小鼠6只，作为对照组，饲养条件完全相同。

2.2 针刺方法 取穴:根据华兴邦《大鼠穴位图谱的研制》[7]，足三里穴定位于小腿前外侧，当犊鼻下三寸，距胫骨前缘一横指处。非穴位点定位于季肋部，髂嵴上方约3 mm处。针刺操作:电针组：束缚小鼠，左侧足三里穴处垂直进针，进针深度5mm，连接电针治疗仪，疏密波，电流强度3mA，电针频率4～30 Hz，刺激10 min 。非穴组：同样方法针刺双侧固定非穴位点。模型组和对照组：不实施任何针刺。

每日固定同一时间点针刺1次，第7、14d全部动物休息1d，干预疗程共21d。各组小鼠每天以同样力度、同样方式，于同样时间进行抓取、固定。

2.3 观察指标及方法 各组治疗结束处死动物后，取其脑组织，放入4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、连续切片。按照免疫组化试剂盒说明书进行染色并检测，每组切片随机观察12个视野后，精确选取其视野内所有阳性颗粒，采用图像分析系统检测阳性颗粒的总面积、面积百分比和积分光度，并对检测结果进行定量分析。

3 实验结果 3.1 各组小鼠大脑皮层区APP蛋白水平表达比较 光镜下，APP蛋白表达的阳性信号定位于细胞浆内，呈棕黄色颗粒。对照组APP阳性细胞少，散在分布，胞体小，染色淡；模型组与非穴组表现为胞体肥大，染色增强，且数量增多，与对照组相比，阳性物质总面积、百分比及积分光度均增加，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；电针组APP阳性细胞散在分布，与模型组及非穴组比较，胞体变小，数量减少，染色减弱，阳性物质总面积、百分比及积分光度均降低，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.01，P<0.01)。非穴组与模型组相比，各指标差异无统计学意义(P>0.05，P>0.05，P>0.05)。结果见图1、表1。

表1 各组小鼠大脑皮层区APP蛋白表达情况

注：与对照组比较，△P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05； 与非穴组比较，◇P<0.05

3.2 各组小鼠大脑皮层区Aβ蛋白水平表达比较 Aβ阳性细胞呈棕黄色。模型组与对照组相比：胞体增大，突起增粗，表达增加，阳性物质总面积、百分比及积分光度均增加，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；电针组与模型组、非穴组相比，各指标均降低，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；非穴组与模型组相比，各指标差异无统计学意义(P>0.05，P>0.05，P>0.05)。结果见图2、表2。

表2 各组小鼠大脑皮层区Aβ蛋白表达情况

注：与对照组比较，△P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05； 与非穴组比较，◇P<0.05

A：对照组 B：模型组 C：电针组 D：非穴组

A：对照组 B：模型组 C：电针组 D：非穴组

4 讨 论 AD是一种神经系统退行性疾病，以进行性记忆减退和认知障碍为主要临床特征。β-淀粉样肽蛋白(Aβ)聚集形成老年斑(SP)为其主要病理特征[8-9]。而Aβ由β淀粉样前体蛋白(APP)水解产生，任何影响APP水解的因素，均可导致Aβ的沉积，从而引起脑部神经元的凋亡、坏死及淀粉样变，此为老年斑形成的始动因子及构成老年斑的核心组分，进而激活胶质细胞，产生神经毒性。

快速老化小鼠SAMP8既有学习记忆缺陷的快速衰老特性，又有淀粉样变性增加、老年斑等AD的重要特征，是目前较为理想的衰老模型[10]。本实验试图通过降低SAMP8小鼠APP和Aβ的表达来抑制老年斑的形成，降低激活神经胶质细胞的数量，以达到保护神经细胞的作用，从而探究延缓AD进程的作用机理。

国内外有关治疗老年性痴呆的方法目前大多数仍处于临床实验阶段，且长期服用一些西药极易引起严重的肝肾损伤[11]。针灸疗法作为祖国医学的重要部分，副作用极少，故而，本实验探究电针对AD小鼠老化关键性蛋白APP与Aβ表达影响，为电针治疗AD的临床选穴提供参考。祖国医学认为AD系老年肾精亏虚、痰凝血瘀所致。足三里为“足阳明胃经”的主要穴位之一，是一身中重要的强壮大穴。传统中医认为，按摩或针灸足三里可以调理脾胃、补中益气、通经活络、疏风化湿。研究还发现针刺足三里能使微血管新生，从而增加脑微循环血流量，改善脑组织供氧[12]。Zhu sx等也报道电针百会、太西、足三里可以降低激活的神经胶质细胞的数量，从而保护神经元，改善AD大鼠的学习记忆能力[13]；张雪竹等研究发现针刺膻中、血海、足三里等穴位能改善脑细胞病理形态，从而提高老年痴呆小鼠的学习记忆能力，改善其认知功能[14]。因此本实验选取“足三里”为其治疗用穴。

实验以SAMR1小鼠为对照，观察电针足三里对SAMP8小鼠大脑皮层β-淀粉样肽前体蛋白APP及Aβ表达水平的影响，结果显示：SAMP8模型组小鼠大脑皮层内APP和Aβ蛋白呈较高表达的状态，电针治疗后明显下调，表现为胞体明显变小，染色强度减弱，数量减少，阳性物质总面积、百分比及积分光度均降低，差异有统计学意义；而电针组APP和Aβ蛋白的表达较SAMR1对照组仍高，差异有统计学意义。提示电针足三里可明显降低APP及Aβ的蛋白表达水平，可在一定程度上改善AD；并且实验还发现电针组和非穴组相比，APP和Aβ蛋白的表达均降低，差异有统计学意义，提示电针足三里较其他部位疗效可靠、作用明确，具有穴位特异性。

综上所述，电针足三里可能通过下调AD小鼠大脑皮层APP及Aβ蛋白的表达水平，从而抑制老年斑的形成，降低激活神经胶质细胞的数量，达到保护神经细胞的作用，延缓AD进程。但是电针足三里治疗AD的途径复杂多样，减少APP水解产生Aβ可能仅是途径之一。此实验只选用了单个穴位，为了更好的为临床服务，仍需要配穴组方进一步验证，从选取最佳组方的角度来探讨针灸延缓AD进程的作用机理。

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(收稿2014-11-29;修回2015-01-13)

Effects of electro-acupuncture at “Zusanli” on the expressions of APP and Aβ in the cortex of Alzheimer's disease mice

Tianjin College of Traditional Chinese Medicine(Tianjin 300193)

Li Chong Han Yanyan Fan Xiaonong

Objective:To investigate the expressing levels of APP and Aβ proteins owing to the influence of electro-acupuncture at “Zusanli” in Seneseenee accelerated mice (SAMP8) brain.Methods: The Seneseenee accelerated mice (SAMP8) were randomLy divided into 3 groups: model group, anelectro-acupuncture group, and sham-acupuncture group. The SAMR1 was used as control. The expressing levels of APP and Aβ proteins were evaluated by immunohistochemical assays.Results: The expressing levels of APP and Aβ proteins in the cortex of Seneseenee accelerated mice were high. They were both reduced by electro-acupuncture compared with model group or sham-acupuncture group. The differences were statistically significant(P<0.01，P<0.01). Meanwhile, there were no statistically significant difference between the various indicators in sham-acupuncture group(P>0.05，P>0.05).Conclusion: Alzheimer's disease could be treated effectively by Electro-acupuncture at “Zusanli”. The mechanism was possibly related to the down-regulated expressing levels of APP and Aβ proteins in the cortex of SAMP8.

Alzheimer disease/acupuncture-moxibustion Electroacupuncture Point ST36 Ainmal experimentation Mice

* 天津市高等学校科技发展基金项目(20090206)

阿尔茨海默病/针灸疗法 电针 穴,足三里 动物实验 小鼠

R749

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.05.049

∆天津中医药大学第一附属医院病理科(天津300193)

▲天津市针灸研究所(天津300193)