胆囊Cajal间质细胞的体外分离、培养与鉴定

谭宇彦，王晶敏，王栋，嵇振岭

(东南大学附属中大医院 普外科，江苏 南京 210000)

·论 著·

胆囊Cajal间质细胞的体外分离、培养与鉴定

谭宇彦，王晶敏，王栋，嵇振岭

(东南大学附属中大医院 普外科，江苏 南京 210000)

目的:探讨兔胆囊Cajal间质细胞(ICC)的原代分离、培养及鉴定的方法。方法:选择出生后4～5周龄的新西兰大白兔，经耳缘静脉注入空气处死，在无菌条件下取出胆囊，在解剖显微镜下剥去胆囊黏膜和黏膜下层，利用Ⅱ型胶原酶消化法分离胆囊原代ICC，接种于含有干细胞因子的M199培养基中进行培养。倒置显微镜下连续观察细胞的形态和生长情况，用酪氨酸蛋白激酶受体c-kit特异性抗体免疫荧光染色进行鉴定。结果：细胞稳定贴壁后，在倒置显微镜下观察可见ICC呈梭形、三角形，有突起；随着培养时间的延长，突起细长化并彼此相互连接形成网络。该类细胞c-kit抗体免疫荧光染色呈阳性。结论：成功建立了一套胆囊原代ICC培养的方法，为研究ICC的生物学特性及其与胆囊动力障碍性疾病的关系奠定了基础。

Cajal间质细胞；胆囊；原代细胞培养

Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是消化道慢波电位的起搏细胞和信号传导细胞， 主要参与基本电节律的产生和调控，对维持消化道正常运动功能起着决定性作用[1]。ICC的异常与多种消化道动力紊乱性疾病密切相关。胆囊收缩功能障碍是胆囊结石的主要病因，ICC对胆囊运动起着重要的调节作用[2]。分离、培养胆囊原代ICC，是研究ICC功能以及胆囊运动障碍在胆石形成过程中相关机制的基础。目前，对于胆囊ICC原代培养的报道甚少。我们研究应用酶解法并结合梯度离心技术，对胆囊原代ICC的培养、分离及鉴定进行初步的探讨。

1 材料和方法

1.1 实验材料

出生后4～5周龄的新西兰大白兔，购自江苏省农科院模式动物研究所，雌雄不限。

M119培养基(美国，HyClone公司)，Ⅱ 型胶原酶(美国，Sigma)，胎牛血清(美国，HyClone公司)，重组干细胞因子(美国，Sigma公司)，Ficoll400分离液(美国，Pharmacia公司)，兔抗c-kit多克隆抗体(美国，Santa Cruz公司)，山羊抗兔FITC标记荧光二抗(美国，Santa Cruz公司)，细胞核抗体DAPI(丹麦，DAKO公司)。

1.2 实验方法

1.2.1胆囊组织单细胞悬液的制备 新西兰大白兔经耳缘静脉注入空气处死，在无菌条件下迅速切除胆囊，纵行切开将胆汁排净，用含1%青链双抗的D-Hank′s液冲洗干净。在解剖显微镜下锐性剥离胆囊黏膜及黏膜下层，再用含1%青链双抗D-Hank′s液反复冲洗2～3次，将胆囊剪碎为1 mm×1 mm小块，放置离心管，加入8 ml Ⅱ 型胶原酶(1.3 mg·ml-1)，37 ℃消化15 min后以1 500 r·min-1离心3 min，去上清液，加入无血清M199培养基5 ml反复吹打3 min，1 500 r·min-1离心5 min，去上清液。用10 ml无血清M199培养基重悬细胞，过200目筛网去除大块组织，将细胞加在等体积20%Fillcoll 400梯度密度液上，1 500 r·min-1离心5 min，取液面交界细胞沉淀。

1.2.2接种细胞 用M199培养基(含20%FBS，1%青链双抗，SCF 5 ng·ml-1)，将细胞浓度调整至1×106ml-1，接种至6孔板，板中预先放置数鼠尾胶原(2 ng·ml-1)包被的盖玻片。放入细胞培养箱(37 ℃，O2浓度95%，CO2浓度5%)。细胞稳定培养8 h后换液，冲去未贴壁的细胞，更换M199培养基(成分同上)继续培养。以后每2天换液1次，注意观察培养基有无浑浊、颜色变淡、漂浮物和絮状物等。

1.2.3免疫荧光鉴定 稳定培养1周后，进行免疫荧光鉴定。倾倒培养基，用PBS漂洗5 min×3次，4%多聚甲醛室温下固定20 min，PBS漂洗5 min×3次，用5%山羊血清室温下封闭30 min，加入兔抗c-kit多克隆抗体(1∶100)4 ℃冰箱过夜。次日取出后用PBS漂洗 5 min×3次，加入DAPI染核5 min，PBS漂洗5 min×3次，封片剂封片，共聚焦显微镜下观察。

2 结 果

2.1 倒置显微镜下ICC形态变化

胆囊原代ICC接种8 h后，在倒置显微镜下见ICC贴壁生长，细胞边界清晰，包体成梭形、纺锤形或三角形，细胞核大，细胞质较少，折光性强，并可见从包体发出的细长突起样结构(图1)，但ICC特有的网络状结构不明显，并可偶见少量条带状平滑肌细胞。随着培养时间延长至72 h后，可见ICC通过侧突相互接触成网状(图2)。

2.2 荧光显微镜下ICC形态学变化

酪氨酸蛋白激酶受体c-kit是ICC特异性标记，通过c-kit抗体免疫染色可以对其进行鉴定。选择培养至7 d的细胞进行c-kit荧光染色，在共聚焦显微镜下观察，可见胞体呈绿色荧光c-kit染色阳性的长梭形细胞即ICC。DAPI复染细胞核后可见细胞核呈蓝色荧光染色(图3)。

图1 ICC体外培养8 h光镜下细胞形态

图2 ICC体外培养72 h光镜下细胞形态

图3 ICC免疫荧光鉴定(c-kit阳性)

3 讨 论

ICC是西班牙神经解剖学家Cajal于1893年在胃肠道奥尔巴赫神经丛(Auerbach′s plexus)、深肌层、环行肌层内观察到的一类特殊的间质细胞[3]，它特异性地表达酪氨酸蛋白激酶受体c-kit，通过c-kit抗体可以对其进行鉴定[4]。目前认为，ICC主要的功能是产生和传导慢波电位，介导神经信号传递，调控消化道运动[5]。研究表明，多种消化道动力障碍性疾病与ICC异常密切相关[6-9]。胆囊结石是消化系统一种常见疾病[10]，ICC数量减少导致的胆囊收缩功能障碍是胆囊结石的主要病因之一[11]。所以，如果能在体外对胆囊原代ICC进行分离、培养和鉴定，对进一步研究ICC的功能、特性以及探讨其对胆囊运动功能的影响在胆囊结石形成过程中的作用机制有着重要的意义。

长期以来ICC的体外培养一直是个难点，我们在总结先前学者们的研究基础上，进行反复的实验，总结了一些关于胆囊原代ICC培养的经验。ICC培养有以下几个问题值得注意:(1) 避免污染。消化道内含有大量的细菌，稍有不慎即可发生污染。我们在实验中发现，一旦发生污染，细胞折光性降低，伸展、贴壁能力丧失，继而发生死亡，所以避免污染是ICC成功培养的前提。在实验过程中，我们在D-Hank′s液和细胞培养基中均加入青链双抗，以减少污染的发生。(2) 缩短胆囊体外存留时间。合理的实验安排和熟练的操作以缩短组织在体外存留时间是保证细胞存活数量的重要因素。因此，我们在处死动物摘取胆囊后，立即对组织进行处理，尽量缩短体外存留时间。(3) 剥离胆囊黏膜及黏膜下层。肥大细胞是消化道除ICC外唯一表达c-kit的细胞，主要位于黏膜层和黏膜下层，而ICC是位于胆囊肌层内[12]。仔细剥离黏膜和黏膜下层能去除肥大细胞并减少其对ICC鉴定的干扰。(4) 严格控制Ⅱ型胶原酶消化时间。Ⅱ型胶原酶消化时间过久对细胞影响较大，国内外文献报道，提取肠道ICC时酶消化肠道组织时间一般为30 min[13]。我们通过反复实验发现，在37 ℃下酶消化胆囊组织时间控制在15 min左右为宜，细胞的成活率相对较高。(5) 梯度离心和早期换液。分离原代ICC的同时也夹杂着部分平滑肌细胞，根据细胞沉降系数和贴壁时间不同的特点，我们利用Ficoll400进行梯度离心，并取液面交界的细胞进行培养；因ICC贴壁时间较平滑肌细胞早，接种8 h候后即换液，可以去除贴壁较晚的平滑肌细胞和活力较差的ICC，为贴壁的ICC生长创造良好的环境，同时也提高了ICC的纯度。(6) 干细胞因子(Stem cell factor， SCF)的作用。SCF是c-kit的天然配体，对ICC正常生长、表型维持、细胞网络的稳定起着重要作用[14]。本实验中，在培养基中加入了5 ng·ml-1的SCF对原代ICC成功培养至关重要。

本实验成功地对胆囊原代ICC进行分离、培养和鉴定，为今后进一步研究ICC的生理特性以及其在胆囊结石发病中的作用机制研究提供了基础。然而，该种方法培养的ICC没有达到较高的纯度，目前有学者通过流式细胞仪和免疫磁珠法来纯化肠道ICC。我们将继续研究，以摸索出一套高效、高纯的胆囊原代ICC培养方法。

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Isolation， culture and identification of interstitial cells of Cajal from gallbladderinvitro

TAN YU-yan，WANG Jing-min，WANG Dong，JI Zhen-ling

(DepartmentofGeneralSurgery，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210000，China)

Objective: To investigate the method of isolation， culture and identification of interstitial cells of Cajal (ICC) from the rabbit gallbladderinvitro. Methods: ICC were derived from gallbladder tissue of New Zealand white rabbit by enzymatic dissociation of collagenase type Ⅱ and cultured in M199 medium. The morphological characteristics of ICC was observed with an inverted microscope， and the cell phenotype was identified by immunofluorescence staining using specific antibody against receptor tyrosine kinase c-kit with the confocal microscopy. Results: ICC exhibited a few triangle or spindle shaped axis-cylinders after cells attachment， and the long processes were observed to build synapse and form the net-work structure of cells after 3 days. Cultured ICC were positive for immunofluorescence staining of c-kit antibody. Conclusion: The enzymolysis method for primary culture of ICC from rabbit gallbladder is feasible， which may provide a basis for research into the biological function of ICC and the relationship between the ICC and gallbladder motility disorders.

interstitial cells of Cajal; gallbladder; primary cell culture

2014-12-18

2015-01-28

江苏省科技计划基金资助项目(7790000049)

谭宇彦(1978-)，男，湖南湘潭人，在读博士研究生，副主任医师。E-mail:tyytyz@sina.com

嵇振岭 E-mail:zlji@vip.sina.com

谭宇彦，王晶敏，王栋，等.胆囊Cajal间质细胞的体外分离、培养与鉴定[J].东南大学学报：医学版，2015，34(3)：390-393.

R657.42

A

1671-6264(2015)03-0390-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.014