肿瘤坏死相关凋亡诱导配体对前列腺癌及膀胱癌细胞增殖、凋亡的作用

李志刚，郝林，范涛，庞昆，韩从辉，

(1.徐州医学院，江苏 徐州 221009；2.徐州市中心医院，江苏 徐州 221009)

·论 著·

肿瘤坏死相关凋亡诱导配体对前列腺癌及膀胱癌细胞增殖、凋亡的作用

李志刚1，郝林2，范涛2，庞昆2，韩从辉1，2

(1.徐州医学院，江苏 徐州 221009；2.徐州市中心医院，江苏 徐州 221009)

目的:研究重组并纯化的肿瘤坏死因子凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白对前列腺癌及膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响。方法:将不同浓度的TRAIL蛋白与培养的前列腺癌细胞(PC-3细胞)和膀胱癌细胞(5637细胞)共孵育24 h后，采用细胞增殖实验及流式细胞术检测肿瘤细胞的增殖及凋亡 。结果：PC-3细胞株中，与未处理组比较，TRAIL蛋白浓度在20、40、80、160 ng·ml-1时细胞增殖率均有显著性差异；而在5637细胞株中，与未处理组比较，TRAIL蛋白浓度在5、10、20、40 ng·ml-1时细胞增殖率均有显著性差异。流式细胞实验结果也证实，随 TRAIL蛋白浓度的增高，两种肿瘤细胞凋亡率增加。结论：重组并纯化TRAIL蛋白可通过抑制前列腺癌及膀胱癌细胞的增殖，诱导其凋亡而产生抗肿瘤的作用。

肿瘤坏死因子凋亡诱导配体；前列腺癌；膀胱癌；增殖；凋亡

膀胱癌和前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率较高[1-3]。目前，对膀胱癌和前列腺癌主要采取手术治疗为主，辅以化疗、免疫治疗、放疗等联合模式，然而这些疗法都具有不可忽视的局限性。当前生物治疗在动物实验和临床试验中显示了巨大的潜力，成为抑制肿瘤发展的一个新的方向。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis ligand， TRAIL)是已知的唯一高度特异性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞没有影响的蛋白质分子，因此，在肿瘤治疗领域具有潜在的应用前景[4-5]。本研究采用细胞生物学的方法研究TRAIL对前列腺癌及膀胱癌细胞增殖及凋亡的作用，探讨其抗肿瘤作用机制，为肿瘤治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞和主要试剂

人前列腺癌细胞株PC-3和人膀胱癌细胞株5637(购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所)，重组人TRAIL含胞外区片段第114～281位氨基酸并纯化的GST-rTRAIL蛋白由前期实验获得[6-7]；二氧化碳恒温孵箱(Thermo Forna，美国)；SW-CJ-IF型超净工作台(苏州净化设备厂)；平底6孔板，96孔板(Coster，USA)；酶联仪(Bio-Tek，美国)；Cell Counting Kit8试剂盒(DOJINDO，日本)；Annexin Ⅴ试剂盒购自Laboratories 公司。流式细胞分析仪(Coulter公司，USA)；胎牛血清(FCS) 、RPMI 1640 培养液，均购自美国Gibco公司。

1.2 细胞培养

人膀胱癌细胞PC3和前列腺癌细胞5637 在含10%胎牛血清、100 U·ml-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的RPMI 1640 培养液中37 ℃、5 %CO2及饱和湿度条件下培养，每周2 次半量换液。

1.3 CCK8检测肿瘤细胞增殖情况

分别将处于对数生长期的PC-3和5637细胞以8×103ml-1接种于96孔板，12 h后实验组每孔加入不同浓度的TRAIL蛋白。5637细胞内TRAIL蛋白浓度分别为1、5、10、20、40 ng·ml-1，PC-3细胞内TRAIL蛋白浓度分别为10、20、40、80、160 ng·ml-1。培养24 h后，每孔加入CCK8试剂10 μl，37 ℃孵育2 h，酶标仪于450 nm波长处检测OD值。以未加TRAIL蛋白的细胞为未处理细胞组，以培养基作为空白对照，每组3孔。细胞增殖率(%)=(实验组OD值-空白对照组OD值)/(未处理细胞组OD值-空白对照组OD值)×100%。

1.4 流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况

分别将PC-3和5637细胞以4×105ml-1接种于6孔板，12 h后5637细胞实验组分别加入TRAIL蛋白5 ng·ml-1和10 ng·ml-1，PC-3细胞实验组分别加入TRAIL蛋白20 ng·ml-1和40 ng·ml-1，培养24 h收集细胞，PBS洗涤2次，结合缓冲液重悬细胞，分别加入AnnexinV-FITC和PI各5 μl， 混匀， 室温避光反应15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 不同浓度TRAIL对PC-3和5637细胞增殖的影响

见表1。

结果显示，TRAIL蛋白抑制了PC-3和5637细胞的增殖率，且随浓度增加，肿瘤细胞增殖率降低。与未处理细胞组相比，PC-3细胞株中除10 ng·ml-1浓度的TRAIL蛋白外，其余各组细胞增殖率均明显下降；而在5637细胞株中，除1 ng·ml-1TRAIL蛋白浓度外，其余各组细胞增殖率均明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 CCK8检测不同浓度TRAIL 对PC-3和5637的增殖率 %

与未经TRAIL蛋白处理组比较， aP<0.05

2.2 TRAIL蛋白对膀胱癌5637细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，TRAIL蛋白能明显提高5637细胞的凋亡率，随剂量增加，肿瘤细胞凋亡增加(图1)。

2.3 TRAIL蛋白对前列腺癌细胞PC-3凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，TRAIL蛋白能明显提高PC-3细胞的凋亡率，随剂量增加，肿瘤细胞凋亡增加(图2)。

图1 流式细胞术检测 5637细胞凋亡率

图2 流式细胞术检测PC-3细胞凋亡率

3 讨 论

TRAIL 是TNF 超家族成员，它通过结合相应的死亡受体TRAIL2R1 (DR4 ) 和TRAIL2R2 (DR5 )激活凋亡机制，选择性地使癌细胞易于凋亡，而不损害正常细胞。本研究结果显示，重组并纯化的TRAIL蛋白主要通过诱导凋亡的方式来发挥对前列腺癌细胞株PC-3和膀胱癌细胞株5637的抑制作用；这种抑制作用与TRAIL的浓度及肿瘤细胞的特性有关，不同来源的肿瘤细胞对TRAIL诱导凋亡发生的起始反应剂量不同。本研究中，在低剂量TRAIL浓度作用下，两种肿瘤细胞的凋亡现象不明显，同时，我们用流式细胞技术观察了TRAIL诱导两种肿瘤细胞凋亡的作用，其结果与细胞增殖测试的结果一致，随TRAIL剂量增加，肿瘤细胞凋亡显著增加。

本研究显示我们前期构建、重组并纯化的TRAIL蛋白能够有效诱导前列腺癌细胞和膀胱癌细胞的凋亡，抑制其增殖，然而其长期抑制肿瘤细胞增殖效果目前尚不清楚。以往研究显示，由于宿主抵抗作用，TRAIL 单药治疗存在肿瘤天然耐药现象。近年来，有不少将TRAIL与化疗药物联合应用治疗肿瘤的研究[8-9]报道。两者联合使用既能有效增强抑瘤效果，又能减少临床上化疗药物的使用剂量，降低细胞的毒性。Shin等研究显示，丹参酮1联合TRAIL治疗前列腺癌，通过上调miR135a-3p 表达促使DR5活性增高从而提高TRAIL诱导前列腺癌细胞凋亡[10]。Ismail等研究结果显示，抗癌药物RG003联合TRAIL治疗前列腺癌能够提高TRAIL诱导凋亡的作用[11]。而有学者报道二甲双胍、吴茱萸碱都可增强TRAIL对人膀胱癌细胞的凋亡作用，通过mTOR/S6K1信号通路分别下调c-FLIP和Mcl-1表达水平[12-13]。因此我们构建、重组并纯化的TRAIL蛋白与化疗药物联合使用能否长期有效地诱导肿瘤细胞的凋亡以及其具体机制有待于进一步深入研究。

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Effect of TRAIL on the proliferation and apoptosis of prostate cancer and bladder cancer cells

LI Zhi-gang1，HAO Lin2，FAN Tao2，PANG Kun2，HAN Cong-hui1，2

(1.XuzhouMedicalCollege，Xuzhou221009，China; 2.XuzhouCentralHospital，Xuzhou221009，China)

Objective: To study the effect of purified tumor necrosis factor-related apoptosis ligand on the proliferation and apoptosis of prostate cancer cell(PC-3 cell) and bladder cancer cell(5637 cell). Methods: PC-3 and 5637 cell line were incubated with different concentrations of TRAIL protein for 24 h. Then cell proliferation and flow cytometry were employed to detect the PC-3 and 5637 proliferation and apoptosis.Results: The significant difference of the cell proliferation rate was found in PC-3 cells when the TRAIL protein concentration was 20，40, 80, 160 ng·ml-1compared with untreated group. In 5637 cells， the cell proliferation rate had significant difference when the TRAIL protein concentration was 5， 10， 20， 40 ng·ml-1compared with untreated group. Flow cytometry results also confirmed that the apoptosis rate of two kinds of tumor cell increased with the TRAIL protein dose dependently. Conclusion: Purified tumor necrosis factor-related apoptosis ligand protein can perform the anti-tumor role by inhibiting proliferation and inducing the apoptosis of the prostate cancer and bladder cancer cells.

tumor necrosis factor-related apoptosis ligand；prostate cancer; bladder cancer; proliferation; apoptosis

2014-11-02

2015-01-27

国家自然科学基金资助项目(81272557)；徐州市中心医院博士(硕士)创新团队科技基金资助项目(XZS2013004)；中美国际合作基金资助项目(2014DFA31480)

李志刚(1975-)，男，江苏徐州人，副主任医师,在读硕士研究生。E-mail:zhigangl75@126.com

韩从辉 E-mail:zhigangl75@126.com

李志刚，郝林，范涛，等.肿瘤坏死相关凋亡诱导配体对前列腺癌及膀胱癌细胞增殖、凋亡的作用[J].东南大学学报：医学版，2015，34(3)：383-386.

R694

A

1671-6264(2015)03-0383-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.012