BVDV河南分离株人工感染家兔试验

卜凡亮　宋明　河南省济源市畜牧局动物卫生监督所　459000

BVDV河南分离株人工感染家兔试验

卜凡亮宋明河南省济源市畜牧局动物卫生监督所459000

为了了解牛病毒性腹泻病毒河南分离株对家兔的致病性，采用腹腔注射方法感染家兔，通过体温测定、临床观察1周后剖杀，采用RT-PCR技术对血清、脾脏、肝脏、淋巴结和肠黏膜进行检测。结果显示，家兔对牛病毒性腹泻病毒河南分离株的感染不呈现明显症状，牛病毒性腹泻病毒分离株对家兔无明显致病变影响。

1　材料与方法

（1）试验地点、时间。本试验于2013年3月24日至5月3日在河南农业大学寄生虫学实验室进行。

（2）试验材料。从郑州市某养殖场购入5只1月龄左右、体重约0.3kg的断奶家兔，临床各项指标正常，精神状态良好，BVDV粪便PCR检测阴性。分笼标记后喂以全价颗粒饲料，自由采食和饮水，隔离饲养1周，每天上、下午各测体温1次，对健康者进行试验观察。毒株与细胞株为牛病毒性腹泻病毒Oregon C24V株，购买于中国兽医监察所，在本试验中做标准对照株；BVDV-MQ01分离株为本次待测株，由寄生虫学试验室分离保存。胎牛肾细胞（MDBK）来源于北京协和细胞资源中心。主要试剂为M-MLV反转录酶、RNase抑制剂、Premix EX Taq DNA聚合酶、DMEM细胞培养基、新生马血清、EDTA、胰蛋白酶，主要仪器为TGL-16B高速台式离心机、PTC-200型PCR仪、DYY-Ⅲ-8B稳压稳流型电泳仪、UV-2000紫外分析仪和紫外凝胶成像系统。

（3）试验方法。迅速地从液氮中取出冻存含有MDBK细胞的冻存管，立即将冻存管放入42℃水浴中快速溶化，然后将含有细胞冻存悬液的冻存管移入离心管中，1000r/min离心5min，弃上清液。将细胞沉淀物移入含有6~8mL完全培养基（含马血清10%）的培养瓶(25mL培养瓶)，置于CO2培养箱（5.0%CO2，37℃）培养24~48h，观察细胞的生长情况。取长成单层MDBK细胞的培养瓶，弃去原培养液，接种OregonC24和BVDV-MQ01的病毒细胞培养液约1mL，吸附1h后弃去病毒液，加入6mL细胞维持液（含有马血清2%~3%）培养，间隔24h观察1次。对照组用不接种病毒的细胞。维持培养72～96h收毒，-70℃保存备用。

将病毒样品作10倍系列稀释，接种至已铺满MDBK细胞单层的96孔培养板中，每稀释度接种8孔，37℃吸附1h后，按0.1mL/孔加入含2%马血清的细胞维持液，放入37℃、5% CO2培养箱中培养。逐日观察记录细胞病变情况，96h后进行判断，采用Reed-Muench法测定纯化BVDV的毒价。TCID50的对数=高于50%病毒稀释对数-相应距离比×稀释系数的对数（10倍递进稀释时为1）。距离比例=1.3.3病毒的浓缩与纯化，采用PEG浓缩法对所收获的病毒液进行浓缩。取反复冻融3次各代次合并后的细胞毒，2000～3000rmp离心15min，取上清液。将上清液装入处理好的透析袋内，用PEG-6000包埋透析袋，4℃作用数小时。待透析袋内的液体量浓缩至原来的1/5～1/10时将其吸出，-20℃保存备用。

分别用灭菌生理盐水（含双抗）将两种纯化病毒稀释至10mL。对照组1只，编号1号，采取腹腔注射2mL含双抗的灭菌生理盐水；试验组4只兔子，编号2~5号，编号为2号和3号的兔子采用腹腔注射分别注入BVDV标准毒株2mL，编号为4号和5号的兔子采取同样的方法分别注入BVDV河南分离株2mL，接种后每天于下午4点测1次体温，记录数据。

接种后每天采集粪便，冷冻备用，于攻毒后7天剖杀，无菌采取脾脏和淋巴结置-70℃保存备用；心脏采血分离血清，置-20℃保存。将组织样品无菌操作放入灭菌平皿中，用含双抗的Hank’s液洗涤3次，剔除组织被膜上所附着的脂肪等结缔组织，将组织样品置乳钵中，剪碎。剪碎后的脾脏组织碎块移入200mL烧杯中，按一定比例加入Hank’s液（含双抗）后匀浆10000r/min离心2min，吸取组织匀浆液于250mL试剂瓶中，-20℃保存。反复冻融3次后，以2000r/min离心15min，吸取上清液，分装入15mL试剂瓶内，-20℃保存。采取RT-PCR方法对所采取的病料进行检测。

病料的RT-PCR检测。(1)引物的设计合成。根据GenBank的公布的BVDV标准毒株Oregon C24V及其他株的5'-UTR保守区设计引物对F和R，该引物扩增出长度为285bp片段，由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。(2)病毒RNA的提取。按照invitrizol公司Trizol说明书提取病料中RNA。(3)反转录cDNA的合成。以RNA为模板，用一扩下游引物F2与R2进行反转录制备cDNA，首先将RNA和下游引物F2、R2混合，70℃水浴10min，冰浴5min，然后加入其他成分。42℃水浴1h，70℃水浴15min。用20μL反应体系进行反转录。(4)PCR扩增cDNA。以cDNA为模板，分别用引物对F1-F2和R1-R2进行PCR扩增，反应按25μL体系进行。(5)琼脂糖凝胶电泳检测。取5μLPCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察目的片段的扩增结果。

2　结果与分析

2.1攻毒前BVDV毒价测定结果

(1)攻毒前采用Reed-Muench法测定纯化。BVDV标准株与分离株BVDV-MQ01的TCID50分别为10~ 5.465与10~6.5TCID50/mL。

(2)攻毒后家兔临床表现情况。攻毒后2天内家兔食欲略有减少，饮欲增加，活动减少，粪便无明显变化，两天后即恢复正常。

（3）攻毒后家兔体温的变化。家兔攻毒后3天内体温均有不同程度的升高，最高体温升高到40.8℃，体温上升幅度最小的也至40℃，且标准毒株组的体温变化比分离组升高明显。4天后试验组家兔体温均恢复正常，直至处死，体温一直处于正常状态。整个试验过程中对照组家兔体温正常。分别将实验组4只兔子的体温与对照组做统计分析（t检验），其P值都远远大于0.05，表明BVDV可以导致家兔短期内体温出现升高，但是整体来说升高幅度并不显著。

（4）实验组家兔剖检脏器病变情况。通过对攻毒1周后的试验兔剖检观察，发现各脏器无明显病变。

（5）RT-PCR结果。RT-PCR扩增结果Fig2 the resuIt of RT-PCR expands increase P阳性对照，血清、淋巴结、脾脏、粪便、肠黏膜，N阴性对照，5种病处理后经RT-PCR扩增，用BVDV OregonC24标准毒株作为阳性对照，经凝胶电泳后均得到一条大小为285bp的特异性条带，扩增片段与预期片段相符。表明试验采集的病料中均含有BVDV河南分离株病毒，人工感染成功。

3　结论与讨论

（1）BVDV与CSFV接种家兔后的异同。BVDV 与CSFV同属瘟病毒属，血清学检测已证明两者在抗原上有相似性，二者间有较近的亲缘关系。CSFV攻毒家兔可以产生定型热，而本试验结果表明，BVDV攻毒家兔后虽有体温变化，但是未出现定型热反应。邓宇等用耳缘静脉的方法将BVDV Oregon C24标准毒株感染3kg左右家兔，研究了BVDV对家兔致病性表现，结果显示家兔攻毒后6h体温有升高，6h后即恢复正常。本试验中家兔0.3kg左右，腹腔注射接毒4天后体温才恢复正常。这一结果表明，家兔对同一BVDV毒株反应的差异可能与所在发育阶段、接种方式和不同的环境变化刺激（温度、饲养环境）有关。

（2）BVDV对不同动物的感染结果。BVDV的主要感染宿主为牛、羊、猪、鹿。实验条件下，大多数感染猪临床上观察不到明显的症状，呈亚临床感染；羊、兔均能产生不具有临床表现的带毒状态。BVDV感染家兔后除了体温变化并无特征性临床症状和明显剖检病变。

（3）BVDV标准株和分离株人工感染家兔结果。BVDV的标准株和分离株人工感染家兔后，临床表现和剖检结果无明显区别，但标准株比分离株引起体温升高明显，由接种前毒价的测定可知，是由于BVDV标准株毒价高于河南分离株。因为时间有限，本实验没有做病理切片进行观察，是否会造成一定的病理变化，还有待于进一步试验证实。

（4）RT-PCR在牛病毒性腹泻病检测中的应用。目前，研究人员建立了很多种方法用于BVDV的检测，如病毒分离、电镜观察、酶联免疫吸附试验(ELISA)、琼扩试验、RT-PCR、实时荧光定量RTPCR方法等。本试验通过对仪器设备及试验目的综合考虑，最终采用RT-PCR方法进行检测。RTPCR技术经济、快速、敏感、特异，可以在实验研究和流行病学调查上大量推广使用。