山茱萸醇提物HPLC指纹图谱及其聚类分析

仲 达，王 艳

(1．海南卫康制药(潜山)有限公司，安徽安庆 246300;2．天津中医药大学中药学院，天津 300193)

山茱萸(cornus officinalis sieb．et zuce)是山茱萸科植物山茱萸的成熟果肉，其成熟后的果实去核后又名山萸肉、药枣、枣皮等，为名贵中药材，具有较高的药用和滋补价值［1]。其味酸、涩，性微温，有涩精、敛汗、补肝肾的功能。山茱萸主要含有环烯醚萜苷类、多糖、有机酸、鞣质等成分［2]。大量研究表明，山茱萸总苷具有显著的免疫调节活性和消炎、抗癌、降血糖、强心等作用。我们的研究表明山茱萸醇提液可通过抑制骨吸收和促进骨形成等途径，使机体骨代谢处于骨形成大于骨吸收的正平衡状态，抑制骨量丢失，防止骨质疏松的发生［3－4]。本研究采用50%乙醇对山茱萸治疗骨质疏松效应成分进行提取［3－4]，建立其醇提物的高效液相(HPLC)指纹图谱，并其色谱峰进行相似度、主成分分析和聚类分析，探讨山茱萸骨质疏松效应的主要成分，为其物质基础研究奠定依据，同时也为其药材质量控制提供一定参考依据。

1 仪器与材料

1．1 仪器 Aglienl－1200四元泵全自动进样液相色谱仪包括DAD检测器、自动进样器、在线脱气、四元泵(美国安捷伦科技公司)。

1．2 材料 10批不同产地的山茱萸药材分别购于河南省、陕西省、浙江省等不同产地、不同时间采集加工，并经天津中医药大学马琳教授鉴定为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，药材来源见表1。

马钱苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号:111640－200604);莫诺苷对照品(天津马克生物制品有限公司，纯度99．19%);甲醇为色谱纯(天津江天化工技术有限公司);乙腈为色谱纯(上海泰瑞尔化学有限公司);其余均为分析纯;水为重蒸馏水。

表1 山茱萸样品来源

2 方法与结果

2．1 色谱条件 色谱柱:Accurasil C18高效液相色谱柱(250 mm ×4．6 mm，5μm);流动相:A 为乙腈—0．15%的磷酸水溶液梯度洗脱，乙腈在0～20 min为9%，20～35 min为9% ～17%，35～60 min为17% ～27%;柱温:30℃;流速:1 mL·min－1;进样量为10μL;检测波长为217 nm。

2．2 供试品溶液的制备［3－6]称取山茱萸药材样品粉末5 g(过3号筛)，置于250 mL圆底烧瓶中，加入50%乙醇40 mL，回流提取3次，每次3 h，滤过，合并滤液，滤液挥干，加0．15%的磷酸水溶解，置5 mL量瓶中，再加0．15%的磷酸水至刻度，摇匀。

2．3 对照品溶液的配制 称取莫诺苷约5 mg，精密称定，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得质量浓度为0．976 g·L－1的对照品储备液。取马钱苷约5 mg，精密称定，置5 mL量瓶中，再加甲醇至刻度，摇匀，得质量浓度为0．997 g·L－1的对照品储备液。取以上两个对照溶液各1 mL于5 mL量瓶中，再加甲醇至刻度，摇匀，得混标溶液。

2．4 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液，按上述的色谱条件重复进样5次，结果12个共有峰的相对保留时间的RSD%均小于0．85%，相对峰面积的RSD%均小于1．7%，符合指纹图谱技术要求。

2．5 稳定性试验 分别取同一份供试品溶液，按照上述的提取工艺制备供试品，采用上述的色谱条件，在0、4、8、12 h 进样，测定，结果 12 个共有峰的相对保留时间的RSD%均小于0．8%，相对峰面积的RSD%均小于1．92%，说明供试品溶液在12 h内稳定。

2．6 重现性试验 取同一批次供试品，按“2．3”项下方法分别制备5份供试品，分别进样测定，结果12个共有峰的相对保留时间的RSD%均小于0．85%，相对峰面积的RSD%均小于1．84%，符合指纹图谱技术规定。

2．7 供试品测定与相似度分析 按“2．1”项下供试品溶液的制备方法处理，在“2．3”项色谱条件下，分别制备10批山茱萸药材的供试品溶液，精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，进样，测定，记录各批图谱。对照品溶液和样品溶液的HPLC图，见图1、2。确定12个共有峰。其中3号峰为莫诺苷，7号峰为马钱苷。相似度分析:运用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》软件进行分析，相似度在0．748～0．919之间。结果见表2。

图1 莫诺苷、马钱苷混合标准液的HPLC色谱图

图2 10批山茱萸提取液的HPLC指纹图谱

表2 指纹图谱共有模式的10批山茱萸样品的相似度计算结果

2．8 山茱萸共有峰的相对保留时间和相对峰面积

选择马钱苷为内参照峰(S)，以其保留时间和峰面积值为1，计算各样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见表3、表4。2．9 聚类分析 将原始数据代入SPSS17．0进行主成分分析，结果见表5、6。从表5中可以看到79．482%的贡献来自前2个主成分，即当提取的主成分数为2时，累计的贡献率已达79．482%，基本保留了原样本的信息。所以确定提取的主成分数为2个。从表6中可以看到主成分1相关系数较接近1，运用SIMCA-P11．5提取两个主成分，根据主成分1的得分值对样品进行优劣排序，结果见表7。可见主成分得分越高，样品性质或特征的相似程度最好，即6号样品的质量最优。

表3 山茱萸指纹图谱共有峰相对保留时间

表4 山茱萸指纹图谱共有峰相对峰面积

为了验证综合主成分分析结果的可靠性及客观性，将原始数据代入SPSS17．0软件，对原始样本数据进行系统聚类分析［11]，结果见图3。10个山茱萸样本基本可以分为两类，即较优品与一般品。其中6、7样品为一类并与1号样品聚为一类，在综合主成分排序中分别占了第1、2、3位，所以为较优品;在剩下的一般品中还可以看出 3、5、9、2、8 是一类，在综合主成分排序中分别占了第 8、9、10、7、6位，质量较差。3、5、9、2、8 和4 又可以成为一类，以此类推，余下的3、5、9、2、8、4、10 号样品聚为一类，为一般品。由主成分分析和系统聚类分析可见两者的结果基本一致，说明综合主成分较全面地表征了原始样本的信息。

表5 特征根、各主成分的贡献率

表6 主成分各因子相关系数

表7 主成分得分值及综合优劣排序

图3 样品的聚类分析图

3 讨论

根据前期的药效学实验结果，我们对10批山茱萸药材50%乙醇提取物进行了相似度评价，其结果的比较采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(A版)，指定参照图谱为10号样品图谱。因为10号样品在10批样品的图谱中在出峰数目，峰形及分离度方面比较适中。采用中位数作为对照图谱生成方法，时间窗宽度设为0．60，运用夹角余弦法对各批次山茱萸样品计算相似度结果见表5。从相似度计算结果可以看出，相似度在0．748 ～0．919 之间。

我们又对10批山茱萸药材进行了主成分分析和系统聚类分析，主因子分析的目的之一是用尽可能少的因子来解释观测到的变量，主成分的特征根及贡献率是选择主成分的依据，从表5中可以看到79．482%的贡献来自前2个因子，基本保留了原样本的信息，所以确定提取的主成分数为2个。从表6中可以看到主成分1相关系数较大，所以主成分1对山茱萸药材的影响最大，而在主成分1中峰7系数值最大，峰11系数次之，说明山茱萸中峰7(马钱苷)含量最高。根据主成分1的得分值对样品进行优劣排序，6号样品排名第一主要是主成分1的得分较高，峰7、峰8、峰9、峰11的主成分值较大引起。一般认为主成分得分越高，样品性质或特征的相似程度最好，因此，以6号样品的质量最优。

为了验证综合主成分分析结果的可靠性及客观性，我们又将山茱萸各共有峰的原始数据进行了系统聚类分析。10个山茱萸样本基本可以分为两类，即较优品与一般品。其中6、7样品为一类并与1号样品聚为一类，在综合主成分排序中分别占了第1、2、3位，所以为较优品;在剩下的一般品中还可以看出3、5、9、2、8 是一类，在综合主成分排序中分别占了第8、9、10、7、6 位，质量较差。3、5、9、2、8 和4又可以成为一类，以此类推。余下的 3、5、9、2、8、4、10号样品聚为一类，为一般品。主成分评价结果与系统聚类法一致，其质量排序结果具有一定的客观性，值得后期山茱萸药材总苷类化合物血清指纹图谱参考。

通过本文结果可以发现，主成分分析方法用于中药质量的评价是切实可行的。本文的评价指标都是基于中药样本的共有有效成分的相对含量，但是中药的质量评价最终还是应以效果为先，所以在获取多个药效指标数据的前提下，主成分评价法的指标可以是相应的多个药效指标，相关的研究工作还将继续。

［1] 国家药典委员会．中国药典［S]．北京:化学工业出版社，2005:249．

［2] 江苏新医学院《中药大辞典》编写组．中药大辞典［M]．上海:上海科学技术出版社，2003:189－190．

［3] 李 平，李 晶，王惠明．山茱萸对去势大鼠骨代谢和骨密度影响的实验研究［J]．天津中医药，2007，24(4):315 －317．

［4] 李 晶，武峻艳，王慧明，等．山茱萸对去势大鼠骨组织形态学影响的实验研究［J]．上海中医药杂志，2010，44(1):69 －72．