IL-31对肺泡Ⅱ型上皮细胞A549表达CCL2的影响

高 婧，杜青波，谭艳芳，岳 欢，黄俊琼，2

（1.遵义医学院检验系，贵州遵义563099；2.遵义医学院附属医院检验科，贵州遵义563099）

IL-31对肺泡Ⅱ型上皮细胞A549表达CCL2的影响

高 婧1，杜青波1，谭艳芳1，岳 欢1，黄俊琼1，2

（1.遵义医学院检验系，贵州遵义563099；2.遵义医学院附属医院检验科，贵州遵义563099）

目的通过体外实验研究IL-31对肺泡Ⅱ型上皮细胞A549表达趋化因子C-C趋化因子配体2（CCL2）的影响，探讨IL-31在支气管哮喘气道炎症中的作用。方法体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞A549，用不同浓度（10、50、100 ng/mL）IL-31作用A549细胞、相同浓度（10 ng/mL）IL-31作用A549细胞不同时间（12、24、36 h），收集细胞，提取细胞总RNA，荧光定量PCR法分析趋化因子CCL2 mRNA的表达情况。结果不同浓度IL-31作用于A549细胞后，趋化因子CCL2的表达较正常未处理组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；10 ng/mL IL-31作用A549细胞后，不同时间段CCL2的表达均增高，且差异有统计学意义（P＜0.05）。结论IL-31作用于肺泡Ⅱ型上皮细胞A549后，趋化因子CCL2的表达明显增高，表明IL-31可能诱导肺组织细胞分泌趋化因子参与哮喘气道炎症过程。

趋化因子CCL2； 白细胞介素类； 肺泡/细胞学； 哮喘； 气管炎

支气管哮喘（简称哮喘）是气道的慢性炎症，是多种炎性细胞的长期浸润和聚集。而趋化因子在激活淋巴细胞、嗜酸性粒细胞，诱导其迁移、黏附和建立化学趋化梯度的过程中发挥重要作用。CC趋化因子配体 2（CCL2）是人类发现最早的、有活性的趋化因子，是CC类趋化因子家族的成员。CCL2在哮喘气道上皮和肺泡灌洗液（BALF）中高表达，能趋化、激活嗜碱性粒细胞和肥大细胞，促使其释放大量组胺和白三烯等，可能参与哮喘的急性发作和气道炎症的形成。IL-31在炎性疾病中发挥重要的作用，有研究证明，IL-31可诱导人支气管上皮细胞表达趋化因子[1]。本实验通过IL-31作用人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549，荧光定量PCR检测A549细胞CCL2的分泌情况，进一步探讨IL-31与哮喘气道炎症的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 人IL-31（近岸蛋白质科技有限公司），RPMI 1640培养基、胎牛血清均购自HYclone公司，总RNA提取试剂盒、荧光定量检测试剂盒均购自天根生物公司，A549细胞由本院微生物教研室王欢教授所赠。

1.2 方法

1.2.1 A549细胞的复苏与培养 将液氮中冻存的装有A549细胞的冻存管取出后，放入37℃温水中使其迅速融化。移液器转移至离心管内，加入RPMI1640培养液，1 000 r/min、离心3～5 min，倒掉废液，加入新的培养液重悬细胞。转移至新的培养瓶中，放入CO2恒温培养箱培养。

1.2.2 A549的传代 A549细胞是贴壁细胞，当铺满培养瓶底80%时，用无菌PBS清洗2次，加入0.25%胰蛋白酶消化液0.2～0.5 mL，室温下平置3～5 min，见瓶底细胞变圆、脱落时，加入含10%小牛血清的RPMI1640培养液，吹打细胞成悬液，转移至新的离心管，1000r/min、离心3～5min，弃废液，加入新的培养液，按1∶2传代后放入CO2培养，适时换液。

1.2.3 不同浓度IL-31作用A549相同时间 将A549细胞传至第2代，按1×105个/瓶培养于25 cm2的细胞培养瓶，加入含10%小牛血清的RPMI1640培养液，细胞同一化12 h，然后加入不同浓度的人IL-31，浓度依次为10、50、100 μg/mL，置入37℃、5%CO2恒温培养箱培养。

1.2.4 相同浓度IL-31作用A549不同时间 将A549细胞传至第2代，按1×105个/瓶培养于25 cm2的细胞培养瓶，加入含10%小牛血清的RPMI1640培养液，细胞同一化12 h，加入相同浓度（10 μg/mL）的IL-31作用于同一化的细胞，在37℃、5%CO2恒温培养箱培养12、24、36 h。

1.2.5 荧光定量PCR检测CCL2的表达 参照试剂盒说明书提取细胞总RNA，逆转录后取0.5 mL的反应管配制20 μL RT-PCR反应液：反应管中依次加入灭菌蒸馏水7μL，CCL2的上、下游引物各0.5μL，荧光染料（SYBR premix Ex TaqTM）10 μL，DNA模板2μL，进行两步法荧光定量PCR：95℃、3 min；95℃、10 s；57℃、30 s；55℃、3s。CCL2引物：上游5′-CTTCTGTGCCTGCTGCTCATA-3′，下游5′-CTTTGGGACACTTGCTGCTG-3′。β-actin引物：上游5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACACC3′，下游5′-CATGGTGGTGCCGCCAGACAG-3′。扩增结果用荧光定量PCR相对定量2-ΔΔCt法的计算方法进行分析。

1.3 统计学处理 以Excel 2007进行统计分析，数据以±s表示，两组间样本比较采用t检验。设定检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度（10、50、100 ng/mL）IL-31作用A549细胞后CCL2的表达 荧光定量PCR分析显示，不同浓度IL-31作用于A549细胞后CCL2的表达均较未处理组增高，差异有统计学意义（t=2.16、2.35、2.30，P＜0.05）。见表1、图1。

表1 不同浓度IL-31对A549细胞表达CCL2的影响（±s）

表1 不同浓度IL-31对A549细胞表达CCL2的影响（±s）

注：-表示无此项；与未处理组比较，t=2.16、2.35、2.30，aP＜0.05。

组别未处理组IL-31组（ng/mL）10 50 100△Ct（CCL2-β-actin）10.39±0.85△△Ct 2-△△Ct--8.71±1.27a9.23±0.60a10.00±1.42a-1.68 -1.16 -0.39 3.21 2.23 1.31

图1 各浓度组A549细胞CCL2的表达

2.2 IL-31不同作用时间对A549细胞表达CCL2的影响 通过荧光定量PCR分析，发现相同浓度IL-31作用于A549细胞后CCL2的表达均较未处理组增高，差异有统计学意义（t=2.30、2.36、2.28，P＜0.05），见表2、图2。

表2 IL-31作用不同时间对A549细胞表达CCL2的影响（±s）

表2 IL-31作用不同时间对A549细胞表达CCL2的影响（±s）

注：-表示无此项；与未处理组比较，t=2.30、2.36、2.28，aP＜0.05。

组别未处理组IL-31组作用时间（h）12 24 36△Ct（CCL2-β-actin） △△Ct 2-△△Ct10.39±0.85--8.88±1.06a8.71±1.27a8.51±1.26a-1.51 -1.68 -1.88 2.85 3.21 3.69

图2 IL-31作用不同时间对A549细胞表达CCL2的影响

3 讨 论

哮喘是一种以气道高反应性和慢性气道炎症为特征的变态反应性疾病，其主要病理生理基础表现为肥大细胞、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞等多种炎症细胞聚集和浸润。哮喘的发病机制有很多种，其中对哮喘发病机制的免疫学研究发现，多种细胞因子，包括IL、炎症介质、趋化因子等参与气道慢性炎症的调节。

IL在哮喘中发挥重要作用，主要包括参与炎症细胞的成熟和活化、调节趋化因子合成和分泌等。其中IL-6是一种重要的促炎性细胞因子，在多种炎性反应中均增高，参与调节Th1/Th2平衡，在哮喘中发挥着重要作用[2]。IL-31是于2004年新发现的细胞因子，为一个具有4个螺旋结构的单链分子[3]，主要功能包括调节细胞增殖分化、促进造血，诱导炎性细胞因子、趋化因子分泌[1，4-5]，属于IL-6家族的成员，主要由激活的Th2细胞分泌。研究发现，IL-31与过敏性疾病关系密切，在哮喘小鼠模型中，肺组织和支气管脱落细胞IL-31R的表达明显增高[3]。表明其在哮喘发作中IL-31可能发挥重要作用。

在哮喘气道慢性炎症的形成中，趋化因子的作用占重要地位。趋化因子是一组具有趋化作用的细胞因子，能吸引免疫细胞到免疫应答局部，参与免疫调节。趋化因子对嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等多种细胞均有趋化作用，在炎症、变态反应等疾病中均有趋化因子及其受体的参与。与哮喘气道慢性炎症的形成有重要联系的趋化因子主要有两大类，CC趋化因子和CXC家族。CCL2属于CXC家族，CCL2与其相应的趋化因子受体CC趋化因子受体2（CCR2）结合后可活化单核/巨噬细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和Th2细胞，并向炎症部位聚集。IL-4与IL-31有非常相似的生物学活性，可以直接促进IgE合成，引起嗜酸性粒细胞聚集、黏液分泌增加，导致气道炎症及气道高反应性[6-8]。体外实验表明，IL-4与IL-31联合可促进支气管上皮细胞表达CCL2[3]。Schneider等[9]证实，由支气管上皮细胞和巨噬细胞产生的CCL2可能有助于加重气道炎症和气道高反应性。有研究发现，IL-31能增强一些趋化因子的分泌，如巨噬细胞来源的趋化因子、胸腺和活化趋化因子及T细胞活化蛋白-3等，并且趋化因子的分泌与IL-31的关系呈正相关[10]。另有研究证实，IL-31刺激人的支气管上皮细胞分泌趋化因子的能力增强，并且与时间和浓度呈依赖性[1]。

作者在前期研究中发现，哮喘小鼠肺组织中趋化因子CCL2表达增高[11]。本研究中，作者用IL-31作用于肺组织来源的A549细胞，观察趋化因子CCL2的分泌情况。采用不同浓度IL-31诱导A549细胞后，用荧光定量PCR检测细胞分泌CCL2的情况。结果显示，在IL-31诱导细胞后，不同浓度IL-31均能上调CCL2的表达。采用同样方法，用10 μg/mL IL-31诱导A549细胞，于12、24、36 h后CCL2的分泌与未处理组相比均增加，这一结果与IL-31募集、活化趋化因子的生物活性有关系。说明IL-31可诱导肺组织细胞分泌趋化因子参与哮喘气道炎症。IL-31促使趋化因子分泌增多，趋化炎症细胞炎症部位，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等，促进这些炎症细胞释放炎症介质，引起气管平滑肌收缩、细胞通透性增加、炎性物质渗出增多、管壁增厚、管腔变窄，形成气道的慢性炎症。长期、反复的炎症刺激导致气管上皮结构改变，气道组织结构重组，加重气管阻力，增加呼吸做功，最终加重哮喘的症状。

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Effect of IL-31 on the expression of CCL2 in typeⅡalveolar epithelial cells A549

Gao Jing1，Du Qingbo1，Tan Yanfang1，Yue Huan1，Huang Junqiong1，2
（1.Department of Clinical Laboratory，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563099，China；2.Department of Clinical Laboratory，the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563099，，China）

ObjectiveTo explore the effect of of IL-31 on airway inflammation of bronchial asthma by studying the effect of IL-31 on the expression of CCL2 in typeⅡalveolar epithelial cells A549 in vitro.MethodsThe typeⅡalveolar epithelial cells A549 were cultured in vitro，with the different-concentration IL-31 solution including 10，50，100 ng/mL acting on them and the same concentration IL-31（10 ng/mL）acting on the them for different times including 12，24 h and 36 h，and then collected the cells and extracted the total cellular RNA.The mRNA expression of chemokine CCL2 were measured by fluorescent real-time PCR assay.ResultsCompared with the normal treatment group，the mRNA expression of chemokine CCL2 was significantly increased with different concentrations of IL-31 impacting on the A549 cells.The difference was statistically significant（P＜0.05）；The mRNA expression of chemokine CCL2 was increased with 10 ng/mL IL-31 impacting on the A549 cells at different time periods.The difference had statistical significance（P＜0.05）.ConclusionThe expression of chemokine CCL2 is obviously increased with the impact of IL-31 acting in type II alveolar epithelial cells A549，which indicates that IL-31 may probably induce lung tissue cells to secrete chemokines involving in asthmatic airway inflammation.

Chemokine CCL2； Interleukins； Pulmonary alveoli/cytology； Asthma； Tracheitis

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.08.001

：A

：1009-5519（2015）08-1121-03

2014-12-30）

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本刊编辑部

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高婧（1988-），女，河南许昌人，硕士研究生，主要从事临床免疫方面研究；E-mail：478729521@qq.com。

黄俊琼（E-mail：junqiongh@aliyun.com）。

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