地诺孕素治疗子宫内膜异位症的机制分析*

张玉虹 梁登辉 孙喜斌 李立楠 焦桂清 贾丽英 刘晓娟

河北北方学院附属第一医院妇科(张家口075000)

地诺孕素治疗子宫内膜异位症的机制分析*

张玉虹 梁登辉 孙喜斌 李立楠 焦桂清 贾丽英 刘晓娟

河北北方学院附属第一医院妇科(张家口075000)

目的：研究地诺孕素治疗子宫内膜异位症(EMT)的信号通路途径。方法：从2012年3月至2013年3月，将我院180例女性患者的子宫内膜组织作为研究对象，根据子宫内膜情况随机分成四组，分别为：正常对照组(45例)；正常地诺孕素组(45例)；异位对照组(45例)；异位地诺孕素组(45例)。以3D胶原凝胶培养对各组细胞在TPL作用凝胶表面积实施测量，记录并对比细胞密度的变化情况。荧光定量测定各组细胞在经地诺孕素作用之后的RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ等相关信号转导通路关键分子基因的表达。结果：异位地诺孕素组在作用后的RhoA水平、ROCKⅠ、ROCKⅡ均分别显著低于异位对照组的，以及正常地诺孕素组的，差异均有统计学意义(均P<0.05)。此外，正常地诺孕素组的RhoA水平、ROCKⅠ、ROCKⅡ均分别显著低于正常对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。异位地诺孕素组在作用后的细胞表面积，均分别显著小于异位对照组，以及正常地诺孕素组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。正常地诺孕素组的细胞表面积、细胞密度，均分别显著小于正常对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论：以地诺孕素治疗EMT疾病的主要作用靶点可能位于Rho/ROCK，且地诺孕素可有效抑制子宫内膜细胞的增殖及纤维化作用，临床治疗时应予以关注。

子宫内膜异位症(EMT)主要特点是子宫内膜组织发生异位生长以及与之相关的盆腔疼痛和痛经，以及不育不孕等。近年来，该病在临床上的发病率有上升的趋势。据统计，大约有80%比例的EMT患者常伴随有盆腔疼痛，而50%的患者则合并有不孕不育[1]。尽管国内外对于EMT进行了较多基础及临床研究，亦取得了一些进展，然而对EMT病因及发病机制仍不甚清楚，因此临床医务工作者们常在治疗EMT时陷入困境，这亦导致EMT逐渐成为了难治之症，有诸多棘手问题需要解决[2]。有报道称[3]，地诺孕素作为一类新药对EMT疾病有较好疗效，然而其具体的作用机制却仍需探索。鉴于此，本文主要对地诺孕素对于EMT的相关机制的探讨，现报道如下。

资料和方法

1 一般资料 从2012年3月至2013年3月，将我院180例女性患者的子宫内膜组织作为研究对象，患者年龄均在25～49岁间，平均年龄为51.3±2.9岁。全部患者均为女性，病程为1～15周，平均病程为7.7±2.3周。其中EMT诊断标准[4]为：①患者有痛经症状，且呈进行性加重，部分患者有不孕和月经不调等症状；②经妇科检查显示子宫增大，附件及结节有触痛感；③B超和腹腔镜显示有累及病变。

2 模型制备 子宫内膜异位囊肿基质细胞(Endometriosis stromal cells，ECSC)与神经干细胞(Neural crest stem cells，NCSC)分离和培养，以及传代。实验组90例取自育龄期患者的子宫内膜，且处于增殖的中晚期，并未经历剥除术的异位性囊肿组织。而对照组90例则取自已排除EMT，并实施子宫全切除术女性患者正常的子宫内膜处组织。全部患者于手术前的一年内并未应用激素治疗。自异位于卵巢的子宫内膜组织内分离出ECSC，并经酶消化后得到ECSC，种植于含100IU/ml的青霉素，50mg/ml的链霉素，以及10%热灭活的FBS，DM EM6孔板内。在37℃及5% CO2条件下培养，约5～6d细胞会长满瓶底，即可传代。将上清液吸除，以2.5g/L的胰酶消化，在显微镜下观察到细胞收缩且变圆之后，吸去消化液，并加入培养液。以吸管吹打瓶壁细胞，扩大培养。ECSCs经3代培养之后，纯度已大于99%。通过含波形蛋白和CD10，及细胞角蛋白和第八因子，以及白细胞共同抗原抗体实施免疫细胞的染色。为下列实验所用。为确保得到足够数量细胞，可选第3代细胞实施实验，且每1次分离后的细胞进行1次实验。

3 研究方法 将180例实验品分成4组，分别为①正常对照组(45例)：即正常培养NCSC组；②正常地诺孕素组(45例)：即以TPL50nM进行处理的NCSC组；③异位对照组(45例)：即正常培养ECSC组；④异位地诺孕素组(45例)，即以地诺孕素50nM进行处理的ECSC组。

4 观察指标 以3D胶原凝胶培养对各组细胞在TPL作用凝胶表面积实施测量，记录细胞密度的变化情况。荧光定量测定各组细胞在经地诺孕素作用之后的RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ等相关信号转导通路关键分子基因的表达，其中RhoA(79bp)上游引物为：“CACGCTCAGCACCTTCATTG”，下游引物为：“TTGTCATAGGTCACTTCACACACAC”； ROCKⅠ(190bp)上游引物为：“GCGGGTTTGCCTACAGGTAGATT”，下游引物为：“ACTTGAAAGTGAAAGTCCCTTCCTC”； ROCKⅡ(272bp)上游引物为：“ATGTCCGACCTGTTACTC”，下游引物为：“GTGGCATCTACTGCACTCTA”；β-actin(142bp)上游引物为：“TGGCACCCAGCACAATGAA”，下游引物为：“CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA”。逆转录试剂盒选用美国TaKaPa公司PrimeScrit RNA产品，RT-PCR试剂盒亦选用该公司SYBR PrimeScript产品，此外兔抗人RhoA多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，β-actin多克隆抗体购自美国Invitrogen公司，PT-PCR扩增仪为美国ABI公司PRISM 7900HT Realtime型。按有关说明书步骤严格操作，明确地诺孕素是否通过Rho/ROCK的途径发挥其作用。

结 果

1 各组定量检测指标的关键分子基因表达水平对比 异位地诺孕素组在作用后的RhoA水平为0.27±0.02，ROCKⅠ为0.32±0.05，ROCKⅡ为0.27±0.12，均分别显著低于异位对照组的0.66±0.03，0.75±0.13，0.69±0.08，以及正常地诺孕素组的0.32±0.11，0.35±0.02，0.31±0.02，差异均有统计学意义(均P<0.05)。表明地诺孕素可明显降低EMT患者RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ等指标的关键分子基因表达水平。此外，正常地诺孕素组的RhoA水平为0.32±0.11，ROCKⅠ为0.35±0.02，ROCKⅡ为0.31±0.02，均分别显著低于正常对照组的0.43±0.02，0.46±0.12，0.36±0.04，差异均有统计学意义(均P<0.05)。表明地诺孕素亦可对正常子宫内膜干细胞分子基因的表达产生一定的降低作用，见表1。

表1 各组定量检测指标的关键

注：与异位地诺孕素组比较，*P<0.05，△P<0.05

2 各组细胞表面积及细胞密度水平对比 异位地诺孕素组在作用后的细胞表面积为211.7±12.3μm2，细胞密度为11.3±2.5/HP，均分别显著小于异位对照组的376.5±15.3μm2，17.5±3.3/HP，以及正常地诺孕素组的251.3±11.4μm2，12.7±2.4/HP，差异均有统计学意义(均P<0.05)。表明地诺孕素可促进有关变异细胞逐渐恢复。此外，正常地诺孕素组的细胞表面积为251.3±11.4μm2，细胞密度为12.7±2.4/HP，均分别显著小于正常对照组的284.3±10.5μm2及15.4±1.2/HP，差异均有统计学意义(均P<0.05),见表2。

表2 各组细胞表面积及细胞密度水平对比

注：与异位地诺孕素组比较，*P<0.05，△P<0.05

讨 论

现如今， EMT治疗目前仍无治愈药物，仅可缓解有关症状，临床上主要是针对不孕及疼痛，并依照患者实际情况加以选择相应的手术及药物，控制患者疼痛，降低复发。朱琴等[5]报道称，可选药物主要集中在怎样降低患者机体雌激素水平的活性方面，故其引发的高复发率逐渐成为了临床上明显的问题。随着人们对EMT认识程度的加深，有关学者从EMT发病机制涉及的信号转导通路等问题入手，通过分子治疗EMT的方案不断得到人们关注[6]。在EMT发生及发展过程中，纤维组织发生过度增殖及纤维化致使瘢痕形成，从而导致慢性疼痛及组织功能的变化[7]。因此，纤维组织的增殖及纤维化可视作EMT特征性病变，故阐明与其有关的纤维化发展潜在机制，找寻一类较为理想的可预防、减轻亦或是逆转EMT的治疗方案，已称为EMT治疗时急待解决的问题[8]。

Rho-Rock是普遍存于机体各组织内的一条信号转导通路，其关键分子主要含Rho、Rock及肌球蛋白磷酸酶[9]。哺乳动物的细胞中，含20种以上不同Rho蛋白，但主要以对RhoA、Racl和Cdc42的研究最为广泛。国外有报道表明[10]，Rho-Rock通路与EMT的进展有较大联系，且与纤维组织发生的过度纤维化有关，因此本文将Rho-Rock通路作为对EMT疾病的研究对象。

地诺孕素是一类混合型孕激素，其可用作临床治疗EMT疾病，可同时发挥天然及合成性孕激素的药理学优点。Thomas等指出，在缓解EMT疼痛上，地诺孕素疗效可相当于醋酸亮丙瑞林，而其安全性及耐受性相对更佳[11]。

本文通过研究发现，异位地诺孕素组在作用后的RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ等指标的关键分子基因表达水平均下降，且异位地诺孕素组在作用后的细胞表面积及细胞密度均显著低于其他各组。表明地诺孕素的抗纤维化效果主要由Rho/ROCK途径实现，其具有抑制细胞的增殖及纤维化的有关分子机制，对治疗EMT疾病有一定疗效。与Luong等[12]报道结果一致，究其原因，笔者认为主要可能是以下几方面：①Rho家族蛋白为细胞信号在转导通路的信号转换器及分子开关。其可重组肌动蛋白骨架蛋白，从而调控细胞生长和形态，及运动和粘附，以及转移与细胞外基质的收缩。②将3D胶原凝胶立体培养体系应用于ECSC，成功构建了EMT纤维化形成的细胞模型。ECSC具有独特生物学特性，其较NESC具有更强收缩性，并且其促纤维化能力是因Rho/ROCK信号转导通路的激活。而这可能是Rock的选择性抑制剂Fasudil抑制ECSC的增殖、收缩，诱发ECSC凋亡，并且抑制ECSC向肌纤维母细胞分化而形成的。Machairiotis等报道证实，Rho-Rock通路选择性阻断剂Y-27632可以改善肾、肺及肝纤维化的程度，这亦表明了Rho-Rock信号通路确实参与纤维化发生及发展进程。而De-Vos等亦研究证实异位子宫内膜有关间质细胞可分化为α-SMA洋相肌纤维母细胞，经地诺孕素治疗后分化能力明显下降，与本文报道基本一致。

综上所述，以地诺孕素治疗EMT疾病的主要作用靶点可能位于Rho/ROCK，且地诺孕素可有效抑制子宫内膜细胞的增殖及变异作用，临床治疗时应予以关注。

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[5] 朱 琴，张红霞，刘 霞，等.子宫内膜异位症术后应用不同治疗周期半剂量促性腺激素释放激素激动剂的疗效观察[J].中华全科医师杂志，2013，12(2)：140-142.

[6] 王丽萍，翁亚娟，王亚金，等.高强度聚焦超声在子宫腺肌症治疗中的价值[J].陕西医学杂志，2012，41(10)：1318-1319.

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[12] Luong HT，Painter JN，Shakhbazov K，etal.Fine mapping of variants associated with endometriosis in the WNT4 region on chromosome 1p36[J].Int J Mol Epidemiol Genet，2013，4(4)：193-206.

(收稿：2014-03-29)

*河北省张家口市科学技术和地震局科研项目(1321081D)

子宫内膜异位症/治疗 @地诺孕素 信号传导

R711.71

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.04.006