纳米银诱导细胞毒性和遗传毒性研究进展

张帮勇，薛玉英，唐萌

(环境医学工程教育部重点实验室，江苏省生物材料与器件重点实验室，东南大学 公共卫生学院，江苏 南京 210009)

·综 述·

纳米银诱导细胞毒性和遗传毒性研究进展

张帮勇，薛玉英，唐萌

(环境医学工程教育部重点实验室，江苏省生物材料与器件重点实验室，东南大学 公共卫生学院，江苏 南京 210009)

伴随纳米银的广泛应用，人体和环境暴露于其的机会迅速增加，其安全性评价越来越受到关注。体外细胞毒性研究表明，纳米银可以穿透细胞膜进入细胞器，进而影响细胞活性，诱导DNA损伤和细胞凋亡。作者就目前纳米银诱导细胞毒性和遗传毒性研究进展作一综述，并从纳米银特性和细胞类型角度讨论对纳米银毒效应的影响。

纳米银； 细胞毒性； 遗传毒性； 文献综述

由于纳米银具有广谱抗菌性，使其在医药领域应用广泛，比如伤口敷料、心血管埋植剂、医用导管和药物载体等[1]。此外，纳米银也应用于食品行业、纺织品、化妆品等领域[2]。伴随纳米银在医药产业和日常生活用品的广泛应用，人体和环境暴露于纳米银的机会迅速增加，而目前关于纳米银的安全性评价体系尚未建立。体内研究表明，纳米银经口、皮肤、呼吸等途径暴露，经血液或淋巴系统循环可以分布到肺、肝脏、肾脏、脾脏，甚至大脑[3-4]。说明纳米银以其特有属性可以穿过生物屏障，对机体器官和组织产生生物学效应。体外研究表明，纳米银可以穿过细胞膜进入细胞器、诱导细胞形态改变、细胞活力下降、线粒体损伤和细胞凋亡；另一方面纳米银可以诱导细胞DNA损伤，染色体畸变和细胞周期抑制[5]。因此，在关注纳米银的健康效应和广泛使用时，关于纳米银的安全性也应受到重视。值得注意的是，体外研究多使用不同特性纳米银暴露于不同细胞，这给纳米银体外安全性评价带来一定困难。作者就近几年关于纳米银体外细胞毒性和遗传毒性研究作一综述，同时从纳米银特性如尺寸、形状、表面修饰和细胞类型角度来讨论影响纳米银毒效应的因素。

1 纳米银诱导细胞毒性

1.1 细胞摄取和分布

纳米银暴露于细胞，被细胞膜受体识别、内在化和转移，最终沉积在细胞或被细胞清除。体外研究显示纳米银可以穿过细胞膜进入细胞器如细胞质、细胞核、溶酶体、线粒体等[6-8]。但是关于纳米银如何进入细胞、在细胞内如何转移的相关报道还比较少。Singh等[9]使用共聚焦显微镜和透射电镜发现水合粒径43.9 nm纳米银染毒小鼠巨噬细胞质中存在纳米银颗粒，进一步研究表明巨噬细胞吞噬纳米银牵涉清道夫受体调节。而Asharani等[10]研究发现,6～20 nm纳米银通过网格蛋白依赖性内吞和大胞饮进入人恶性胶质瘤细胞，并且存在时间依赖性胞吐，但胞吞速度大于胞吐。

1.2 细胞活性改变

细胞形态学改变是细胞损伤最直观的体现，研究表明多种细胞暴露纳米银可以引起细胞收缩、形态不规则，并且具有剂量依赖性[10-12]。除了形态学改变，纳米银诱导细胞活性改变在许多研究中也被报道。细胞活性可以体现细胞的存活、死亡和新陈代谢活动。体外研究发现纳米银染毒人皮肤癌细胞、人纤维肉瘤细胞、人肺癌上皮细胞、人白血病细胞、人肝癌细胞活性呈现剂量依赖性下降[12-14]。乳酸脱氢酶(LDH)广泛存在于细胞质中，可以将乳酸转化为丙酮酸，当细胞质膜完整性被破坏，LDH流出。因此，细胞上清液中LDH活力也可以作为细胞损伤标志。纳米银染毒人白血病细胞和肝癌细胞都发现细胞上清液中LDH活力增强[14]，表明细胞膜完整性受损。

1.3 细胞凋亡及相关机制研究

纳米银诱导细胞损伤，最终引起细胞凋亡/坏死。Foldbjerg等[13]发现纳米银[(69±3)nm]染毒人肺癌上皮细胞坏死/晚期凋亡呈剂量依赖性增加。此外，纳米银诱导小鼠巨噬细胞和人急性髓性白血病细胞凋亡率增加也被报道[9,15]。关于纳米银诱导细胞凋亡机制，目前还不清楚。体外研究报道纳米银可以通过肿瘤坏死因子受体通路、线粒体途径、DNA损伤通路和活性氧通路等诱导细胞凋亡[16]。

1.3.1线粒体途径 线粒体在细胞存活与死亡中扮演重要的角色，凋亡中多种关键事件涉及线粒体，包括释放含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)活化剂(如细胞色素C)、改变电子转移、线粒体膜电位丢失、改变细胞内氧化还原、参与抗凋亡Bcl-2家族蛋白[17]。Piao等[18]发现5～10 nm纳米银通过氧化应激诱导人肝细胞凋亡，通过调整Bax和Bcl-2表达，导致线粒体膜电位下降，进而释放细胞色素C激活caspases 9和3，引起细胞凋亡。线粒体膜电位的下降可以作为细胞应激早期指示器，引起线粒体功能紊乱，反过来引起细胞损伤。Guo等[15]发现人急性髓性白血病细胞暴露于11 nm聚乙烯吡咯烷酮(PVP)包被纳米银，可以诱导细胞线粒体膜电位下降。

1.3.2活性氧与细胞凋亡 体外研究显示纳米银可以诱导多种细胞内活性氧(ROS)增加[6,11,15]。当细胞内自由基生成远远大于自身清除能力时，就会诱导细胞氧化应激。在细胞水平，氧化应激可以诱导细胞从增殖到生长抑制、衰老甚至死亡[19]。N乙酰半胱氨酸(NAC)经常作为抗氧化剂用于体外研究。Guo等[15]使用11 nm PVP包被纳米银对人急性髓性白血病细胞染毒24 h，使用NAC前处理细胞，发现5 mmol·L-1NAC能有效阻止细胞内活性氧产生、细胞线粒体膜电位下降、DNA损伤和细胞凋亡。Kim等[6]发现,10 mmol·L-1NAC前处理人肝癌细胞可以减少ROS产生，提高细胞活性，减少DNA损伤。机体本身具有清除自由基的能力，比如谷胱甘肽(GSH)和维生素C等非酶系物质、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶(SOD)等酶系。Arora等[12]使用7～20 nm纳米银对人皮肤癌细胞和人纤维肉瘤细胞染毒，发现纳米银可以降低两株细胞GSH含量，减少SOD活力，增加脂质过氧化作用，表明纳米银进入细胞后引起细胞内氧化还原体系失衡，过多的自由基进一步引起细胞损伤。此外，过多的活性氧持续存在，将激活细胞信号通路，比如促分裂原激活蛋白激酶通路、细胞外信号调节激酶通路、肿瘤抑制蛋白p53信号、核因子κB信号，进而引起基因表达改变，诱导细胞存活或死亡[19]。

2 纳米银诱导遗传毒性

2.1 DNA损伤和染色体畸变

在研究纳米银遗传毒性时，一些经典的毒理学方法如彗星试验、微核试验和染色体畸变分析被应用。Asharani等[7]使用彗星试验和微核试验发现，6～20 nm淀粉包被纳米银诱导正常人肺成纤维细胞和人脑胶质瘤细胞DNA尾距和微核数量增加。Mei等[20]使用5 nm未包被纳米银对鼠淋巴瘤细胞染毒，发现在3～6 μg·ml-1染毒浓度下细胞突变体增加；通过杂合型丢失分析胸苷激酶突变发现纳米银诱导染色体改变。Asharani等[10]也发现6～20 nm纳米银在25 μg·ml-1剂量下能引起正常人肺纤维细胞和恶性胶质瘤细胞染色体畸变。Sahu等[21]采用细胞松弛素B阻滞微核试验研究20 nm纳米银对人肝癌细胞和结肠癌细胞遗传毒性，结果显示两株细胞中具双核的细胞呈现浓度和时间依赖性增加。之后Sahu等[22]又使用流式细胞术来评估20 nm纳米银染毒人肝癌细胞和结肠癌细胞微核率，结果表明，人肝癌细胞微核率呈浓度依赖性增加，人结肠癌细胞微核率也有增加。

和以上关于纳米银诱导细胞微核增加和染色体畸变报道相比，其他研究还有不同的报道。Kim等[23]使用小于100 nm纳米银对鼠淋巴瘤细胞和人支气管上皮细胞染毒，通过彗星试验发现显著增加细胞尾距，但没有发现诱导细胞突变。同样地，Nymark等[24]研究PVP包被纳米银对人支气管上皮细胞遗传毒性，发现纳米银染毒细胞尾距显著增加，但是没有发现微核形成和染色体畸变。可能原因是PVP包被减少了纳米银和细胞的直接交互，或者PVP减少了银离子释放，或者是纳米银聚集减少了细胞吸收。由此可见，纳米银特性和细胞类型对纳米银诱导遗传毒性有影响；相比之下，彗星试验在评估遗传毒性时比微核试验和染色体畸变分析更敏感。

DNA损伤类型中最严重的是DNA双链断裂，如果修复不及时，可以引起细胞死亡，或造成染色体转位及遗传信息丢失[25]。近些年的研究发现组蛋白H2AX磷酸化(γ-H2AX)有可能成为衡量DNA损伤程度，特别是DNA双链断裂的良好指标[25]。Ahamed等[26]发现，25 nm纳米银染毒鼠胚胎干细胞和鼠胚胎纤维母细胞中DNA损伤修复蛋白Rad51表达增加，组蛋白H2AX磷酸化。在纳米银染毒人肝癌细胞中也发现γ-H2AX存在剂量依赖性增强[6]。除了DNA双链断裂，一般认为DNA加合物形成是多阶段致癌作用中的关键起始事件。体外研究发现，纳米银染毒人肺癌上皮细胞DNA加合物增加[13]，表明细胞DNA受损。

2.2 细胞周期阻滞

细胞周期是细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。在细胞增殖过程中有4个明显的阶段：DNA合成准备期(G1期)、DNA合成期(S期)、蛋白质合成和有丝分裂准备期(G2期)和有丝分裂期(M期)。Liu等[27]发现人肝癌细胞暴露于5、20、50 nm纳米银，细胞周期在G1期减少，在S期阻滞。此外，纳米银诱导鼠成纤维细胞、人肺纤维细胞和胶质瘤细胞在G2/M期阻滞也被报道，细胞在G2/M期阻滞表明DNA损伤并启动修复，如果修复不成功，可能导致细胞死亡[7-8]。

3 影响毒性效应因素

3.1 尺寸

Liu等[27]发现5 nm纳米银比20 nm和50 nm纳米银更加容易进入人肝癌细胞，诱导更强的细胞增殖、细胞膜损伤、活性氧产生、细胞周期抑制和细胞凋亡。同样地，Avalos等[14]使用不同尺寸纳米银染毒人肝癌细胞和白血病细胞，发现4.7 nm比42 nm纳米银能诱导更大的细胞增殖抑制和细胞膜损伤。关于小尺寸纳米银诱导更强的毒效应机制还不清楚，小尺寸纳米银可能更加容易通过细胞膜进入细胞器，进而引起细胞损伤。此外，小尺寸纳米粒子具有更大的比表面积和更高的表面反应活性，可能诱导更强的细胞损伤。

3.2 表面化学修饰

为改善纳米银分散性和稳定性，经常对纳米银进行表面修饰，比如淀粉、多糖、碳氢化合物、缩氨酸、PVP和柠檬酸钠等。不同表面修饰可能影响纳米银与细胞相互作用，目前体外关于不同表面修饰纳米银诱导毒效应研究较少。Ahamed等[26]使用25 nm多聚糖包被纳米银和未包被纳米银对鼠胚胎干细胞和鼠胚胎纤维母细胞染毒，结果表明多聚糖包被纳米银比未包被纳米银表现更大的细胞和遗传毒性。可能是包被的纳米银比未包被纳米银分散性更好，不容易聚集，因此更加容易进入细胞器，引起生物学作用。而Nguyen等[28]发现，未包被纳米银比PVP和柠檬酸盐包被纳米银对鼠巨噬细胞和人结肠上皮细胞活性抑制性更大；进一步研究发现，未包被纳米银可能诱导细胞氧化应激，而包被纳米银可能通过上调特定细胞因子诱导细胞损伤。

3.3 形状

纳米银具有优越的物理、化学和生物学特征，使其广泛应用。而纳米银应用性能除了受尺寸、纯度等因素影响，还与纳米银形状密切相关。因此不同形状纳米银被制备，比如球形、棒状、三角形和线型等。目前体外细胞毒性研究多使用球形纳米银，而不同形状纳米银体外毒性研究较少。Pal等[29]发现纳米银抗菌具有形状依赖性，切去顶端的三角形比球形和棒状纳米银显示更强的抗菌性。因为切去顶端的三角形纳米银包含超过﹛111﹜晶面，表现更高的反应性。Stoehr等[30]研究线型纳米银(长度1.5～25 μm，直径100～160 nm)、球形纳米银(30 nm)和微米银(<45 μm)对肺上皮细胞A549毒效应的差异，结果发现：线型纳米银诱导显著的细胞活性下降、LDH释放率增加和早期钙内流，而球形纳米银对细胞几乎没有影响。差异原因可能是线型纳米银可以和细胞直接交互作用而不是通过内在化。

3.4 细胞类型

考虑到随着纳米银的广泛应用，其可以通过不同暴露途径进入机体，进而分布到不同组织器官，因此不同的细胞被用于纳米银体外毒性评估模型，而不同细胞暴露纳米银又表现出毒效应差异。Faedmaleki等[31]发现，人肝癌细胞和小鼠原代肝细胞暴露于20～40 nm纳米银24 h的IC50分别是2.764 μg·ml-1和121.7 μg·ml-1。Asharani等[10]研究6～20 nm纳米银对人恶性脑胶质瘤和人正常肺成纤维细胞增值抑制作用，发现纳米银对肿瘤细胞具有较明显的增殖抑制作用，可能原因是成纤维细胞可以从细胞周期阻滞中恢复，而癌细胞停止增殖。Mukherjee等[11]研究表明，人宫颈癌上皮细胞比永生化的人角质形成细胞对纳米银更加敏感，可能是由于两株细胞本身抗氧化能力不同导致。综上可知，原代细胞比永生化细胞株对纳米银抗毒性效应更强，细胞自身属性不同对纳米银反应也不同。

4 小结与展望

伴随纳米银产品的快速发展，人暴露纳米银机会增加，许多研究已经开始关注纳米银毒性效应。作者主要集中于论述纳米银体外诱导细胞毒性和遗传毒性，并从纳米粒子特有属性和细胞角度探讨其对毒效应影响。虽然纳米银体外毒性研究报道很多，但大多数报道是描述性毒理学内容，而缺少关于纳米银诱导细胞和遗传毒性机制研究。因此，未来的研究应该更加关注机制研究，阐明纳米银诱导毒效应机制，为纳米银更好地应用提供保证。值得注意的是，体外实验多采用独立的方法评估纳米银毒效应，而且不同研究使用的纳米银物理化学特性和细胞模型也不相同，给纳米银体外毒性评估带来困难。因此，建立一套标准的纳米银体外毒性评估实验流程显得尤为重要。

[1] CHALOUPKA K，MALAM Y，SEIFALIAN A M.Nanosilver as a new generation of nanoproduct in biomedical applications[J].Trends Biotechnol,2010，28(11):580-588．

[2] LEM K W，CHOUDHURY A，LAKHANI A A，et al.Use of nanosilver in consumer products[J].Recent Pat Nanotechnol，2012，6(1):60-72．

[3] CHEN X，SCHLUESENER H J.Nanosilver:a nanoproduct in medical application[J].Toxicol Lett，2008，176(1):1-12．

[4] AHAMED M，ALSALHI M S，SIDDIQUI M K J.Silver nanoparticle applications and human health[J].Clin Chim Acta，2010，411(23-24):1841-1848．

[5] ZHANG T，WANG L，CHEN Q，et al.Cytotoxic potential of silver nanoparticles[J].Yonsei Med J，2014，55(2):283-291．

[6] KIM S，CHOI J E，CHOI J，et al.Oxidative stress-dependent toxicity of silver nanoparticles in human hepatoma cells[J].Toxicol In Vitro，2009，23(6):1076-1084．

[7] ASHARANI P V，LOW K M G，HANDE M P，et al.Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in human cells[J].ACS Nano,2009，3(2):279-290．

[8] WEI L N，TANG J L，ZHANG Z X，et al.Investigation of the cytotoxicity mechanism of silver nanoparticlesinvitro[J].Biomed Mater，2010,5(4):044103．

[9] SINGH R P，RAMARAO P.Cellular uptake，intracellular trafficking and cytotoxicity of silver nanoparticles[J].Toxicol Lett，2012，213 (2):249-259．

[10] ASHARANI P V，HANDE M P，VALIYAVEETTIL S.Anti-proliferative activity of silver nanoparticles[J].BMC Cell Biol，2009，10:65．

[11] MUKHERJEE S G，O’CLAONADH N，CASEY A，et al.Comparativeinvitrocytotoxicity study of silver nanoparticle on two mammalian cell lines[J].Toxicol In Vitro，2012，26(2):238-251．

[12] ARORA S，JAIN J，RAJWADE J M，et al.Cellular responses induced by silver nanoparticles:invitrostudies[J].Toxicol Lett，2008,179(2):93-100．

[13] FOLDBJERG R，DANG D A，AUTRUP H.Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in the human lung cancer cell line，A549[J].Arch Toxicol，2011，85(7):743-750．

[14] AVALOS A，HAZA A I，MATEO D，et al.Cytotoxicity and ROS production of manufactured silver nanoparticles of different sizes in hepatoma and leukemia cells[J].J Appl Toxicol，2014，34(4):413-423．

[15] GUO D W，ZHU L Y，HUANG Z H，et al.Anti-leukemia activity of PVP-coated silver nanoparticles via generation of reactive oxygen species and release of silver ions[J].Biomaterials，2013,34(32):7884-7894．

[16] 周国凤，汤京龙，奚廷斐，等.纳米银诱导细胞凋亡的研究与进展[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(42):8314-8318．

[17] GREEN D R，REED J C.Mitochondria and apoptosis[J].Science，1998,281(5381):1309-1312．

[18] PIAO M J，KANG K A，LEE I K，et al.Silver nanoparticles induce oxidative cell damage in human liver cells through inhibition of reduced glutathione and induction of mitochondria-involved apoptosis[J].Toxicol Lett，2011，201(1):92-100．

[19] MARTINDALE J L，HOLBROOK N J.Cellular response to oxidative stress:Signaling for suicide and survival[J].J Cell Physiol，2002,192(1):1-15．

[20] MEI N，ZHANG Y，CHEN Y，et al.Silver nanoparticle-induced mutations and oxidative stress in mouse lymphoma cells[J].Environ Mol Mutagen，2012，53(6):409-419．

[21] SAHU S C，ROY S，ZHENG J，et al.Comparative genotoxicity of nanosilver in human liver HepG2 and colon Caco2 cells evaluated by fluorescent microscopy of cytochalasin B-blocked micronucleus formation[J].J Appl Toxicol，2014，34(11):1200-1208．

[22] SAHU S C，NJOROGE J，BRYCE S M，et al.Comparative genotoxicity of nanosilver in human liver HepG2 and colon Caco2 cells evaluated by a flow cytometricinvitromicronucleus assay[J].J Appl Toxicol，2014，34(11):1226-1234．

[23] KIM Y J，YANG S I，RYU J C.Cytotoxicity and genotoxicity of nano-silver in mammalian cell lines[J].Mol Cell Toxicol，2010,6(2):119-125．

[24] NYMARK P，CATALAN J，SUHONEN S，et al.Genotoxicity of polyvinylpyrrolidone-coated silver nanoparticles in BEAS 2B cells[J].Toxicology，2013，313(1):38-48．

[25] 沈筱筠，闫春兰，杨军.DNA双链断裂诱导的细胞损伤应答反应研究进展[J].中国药理学与毒理学杂志，2010，24(6):539-542．

[26] AHAMED M，KARNS M，GOODSON M，et al.DNA damage response to different surface chemistry of silver nanoparticles in mammalian cells[J].Toxicol Appl Pharmacol，2008，233(3):404-410．

[27] LIU W，WU Y，WANG C，et al.Impact of silver nanoparticles on human cells:effect of particle size[J].Nanotoxicology，2010，4(3):319-330．

[28] NGUYEN K C，SELIGY V L，MASSARSKY A，et al.Comparison of toxicity of uncoated and coated silver nanoparticles[C].J Phys Conf Ser,2013，429:12025．

[29] PAL S，TAK Y K，SONG J M.Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle？ A study of the gram-negative bacterium Escherichia coli[J].Appl Environ Microbiol，2007，73(6):1712-1720．

[30] STOEHR L C，GONZALEZ E，STAMPFL A，et al.Shape matters:effects of silver nanospheres and wires on human alveolar epithelial cells [J].Part Fibre Toxicol，2011，8:36．

[31] FAEDMALEKI F，SHIRAZI F H，SALARIAN A A，et al.Toxicity effect of silver nanoparticles on mice liver primary cell culture and HepG2 cell line[J].Iran J Pharm Res，2014，13(1):235-242．

2015-04-18

2015-05-25

国家重大科学研究计划项目(2011CB933404)；国家自然科学基金资助项目(81172697；81473003)；江苏省自然科学基金资助项目(BK2011606)

张帮勇(1989-)，男，河南信阳人，在读硕士研究生。E-mail:bangyong2009@163.com

薛玉英 E-mail：yyxue@seu.edu.cn

张帮勇，薛玉英，唐萌.纳米银诱导细胞毒性和遗传毒性研究进展[J].东南大学学报：医学版，2015，34(5)：836-840．

R114

A

1671-6264(2015)05-0836-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.035