磁性纳米材料对骨髓间充质干细胞行为影响的研究进展

曹国瑞，计中青，朱舟婷，孔凌云，潘天帆，周昕

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.东南大学 生物科学与医学工程学院，江苏 南京 210009)

·综 述·

磁性纳米材料对骨髓间充质干细胞行为影响的研究进展

曹国瑞1，计中青1，朱舟婷1，孔凌云1，潘天帆1，周昕2

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.东南大学 生物科学与医学工程学院，江苏 南京 210009)

对当前磁性纳米材料和骨髓间充质干细胞(BMSCs)的制备方法及表征手段进行总结，归纳多种磁性纳米材料进入BMSCs的方法和鉴定纳米颗粒-BMSCs细胞活性及分化能力的方法，概述封装有磁性纳米颗粒的BMSCs在细胞水平、动物实验及临床上的应用情况，分析其应用于临床必须解决的问题，并展望该领域的发展前景。

磁性纳米颗粒； 骨髓间充质干细胞； 文献综述

磁性纳米材料指尺度为1～100 nm的磁性材料，目前以铁系氧化物居多。磁性纳米材料通常在磁性纳米颗粒表面修饰上多种生物大分子或者靶的配体，这样就既具备良好的磁导向性，也具有良好的生物相容性或者靶向性，可与多种功能分子如蛋白质、核酸和维生素等结合，实现磁靶向应用[1]。磁性纳米颗粒的应用主要见于：可作为药物载体，通过外加磁场的作用将药物靶向定位；可应用于磁共振成像(MRI)作为对比造影剂进行体内示踪、细胞筛选、生物分离和基因治疗等。Mah等[2]将携带有治疗基因的病毒载体包被到磁性载体的表面，当磁性载体到达靶部位时通过体外磁场使其滞留在靶部位，这样可使病毒较长时间接触靶组织，从而增加基因转染和表达的效率。

1987年Friedenstein等[3]首次从骨髓中分离获得骨髓间充质干细胞(BMSCs)，自此BMSCs移植在动物实验和临床应用中得到了重视和发展。BMSCs在体外特定的诱导条件下或体内特定环境下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、骨髓基质、肌腱及韧带等组织[4]。BMSCs具有定向迁移至损伤部位进行增殖、分化并修复损伤组织的能力[5]。BMSCs取材容易，对机体损伤小，且体外培养简单，细胞扩增速度快，由于自体移植无明显的免疫排斥反应，也不涉及伦理道德问题，具有良好的临床应用前景，因此，目前在组织工程、基因工程等研究中成为理想的种子细胞，在临床疾病的治疗过程中，对骨骼系统疾病、肝脏纤维化、心脏疾病的治疗具有很高的价值[6]。

随着磁性纳米材料技术的发展与成熟，利用MRI标记细胞进行活体示踪的研究成为当前热点[7-9]。研究者设想将磁性纳米颗粒封装入BMSCs，在保证BMSCs生物活性和分化潜能的前提下，在外加磁场的作用下，可实现BMSCs在机体内的靶向定位，同时因为磁性纳米颗粒可作为MRI的对比增强剂，可以实现BMSCs的体内示踪，动态观察BMSCs的迁移和增殖过程，将磁性纳米颗粒封装入BMSCs，可以充分发挥两者的优势，因而具有广阔的应用前景。

1 磁性纳米材料和BMSCs的制备方法

1.1 常见磁性纳米材料制备方法

磁性纳米材料一般是铁氧化物，其制备方法通常有干法与湿法。干法是指在比较剧烈的条件下，使铁的配合物分解以得到铁的纳米材料；湿法包括空气氧化法、共沉淀法、微乳液法及热分解法。目前在有机相中用的最多的是热分解法，在水相中则为共沉淀法。热分解法是指使用高沸点有机溶剂，使铁的配合物在高温下分解，经过氧化和部分还原得到产物[10]；而共沉淀法是指在液相中将沉淀剂加入到含有铁离子和亚铁离子的溶液中，生成磁性纳米颗粒。

1.2 BMSCs的制备方法

BMSCs主要存在于骨髓组织中，具有贴壁生长的特性，通过全骨髓贴壁分离的方法，经多次传代，可以获得比较纯净的BMSCs[11]。目前制备BMSCs的方法主要有流式细胞仪分离法、免疫磁珠法、贴壁筛选法及密度梯度离心法等[12]。其中免疫磁珠法和流式细胞仪法制得的细胞活性低下，操作繁琐，较少使用。目前应用较多的方法是将密度梯度离心法和贴壁筛选法相结合，即通过离心使成纤维细胞和其他单核细胞分离，接种于培养瓶后，利用BMSCs的贴壁生长性，获得足量的BMSCs[12-14]。

2 磁性纳米材料对BMSCs的影响

2.1 磁性纳米材料进入BMSCs的过程和方法

多个实验[6，10，15-16]表明，磁性纳米颗粒及细胞膜表面都带负电荷，两者相互排斥，这使得磁性纳米颗粒在自然状态并不能有效地被哺乳动物细胞摄取，标记率低，因此为达到磁性标记细胞的目的，必须通过修饰细胞，再经由吞噬作用、液相胞饮作用、受体介导的吞噬作用和转染作用促进细胞对其摄取。为了将磁性纳米颗粒成功导入BMSCs，目前常用的方法是使用带正电荷的基团包裹纳米颗粒，基团必须具备生物相容性和可降解性，以避免损伤正常组织。国内学者做了不少相关工作。于春鹏[6]选用带正电荷的转染剂多聚赖氨酸(PLL，0.75μg·ml-1)，它包裹带负电荷的纳米颗粒，形成两者的聚合体，更容易穿越带负电荷的细胞膜进入细胞。陈鹏等[10]使用葡聚糖包被的磁性纳米颗粒与BMSCs共培养，封装好的细胞增殖和分化能力均与对照组无明显差异，磁性纳米颗粒晶体表面包裹葡聚糖形成的核壳式结构阻止了氧化铁颗粒水溶进程并保护细胞不受Fe的毒害，是当前使用比较广泛的一种包被磁性纳米颗粒的方法。陈瀛[15]用接种了氨(Fe304-Si02-NH2)的二氧化硅(SiO2)包裹磁性纳米颗粒，使得细胞对磁性纳米颗粒的吞噬率大大提高。金旭红等[16]用硫酸鱼精蛋白包裹磁性纳米颗粒，可使纳米颗粒成功进入BMSCs，同时不影响细胞活性和分化能力。

虽然包被纳米颗粒的方法很多，可以使纳米颗粒成功导入BMSCs，但是包被好的纳米颗粒进入细胞的过程和方式尚不清楚，缺乏相关研究，另外不同研究中纳米颗粒的性质和形态也并不统一。至于BMSCs摄取磁性纳米颗粒的过程是否受外加磁场的影响，也未见相关报道。

2.2 适宜的纳米颗粒质量浓度和共同孵育时间

关于纳米颗粒标记BMSCs的适宜浓度，多个研究[10，15，17-18]报道所用纳米颗粒的质量浓度有所不同。这可能是不同研究使用的纳米颗粒直径和表面包被的修饰物不同，每个实验室的研究条件也不一样的原因所致。张瑞平等[19]总结前人的研究成果得出纳米颗粒合适的质量浓度是20～50 (μg Fe)·ml-1，此浓度为磁性纳米颗粒的理想标记浓度，此浓度下BMSCs标记率高，且纳米颗粒的细胞毒性及其对BMSCs的增殖活性影响较小。一般文献报道中常用的超顺磁性纳米铁离子(SPIO)标记细胞的浓度通常在10～20 μg·ml-1。最新研究显示，SPIO有效标记BMSCs的最低质量浓度为15 mg·L-1[20]，在15 mg·L-1时，SPIO对BMSCs标记效率较高，且不影响其存活、增殖。但对纳米颗粒和BMSCs共同孵育的时间基本一致，为18～24 h[18-20]，时间过短降低了BMSCs的标记率，时间过长影响细胞活性。

2.3 磁性纳米颗粒和BMSCs结合物(纳米颗粒-BMSCs)的鉴定方法

多个研究[11-15，17-18]证实，在适宜的浓度范围内，磁性纳米材料对BMSCs的形态、生长、迁移、成骨分化能力等无明显影响，磁性纳米材料具有良好的生物相容性。鉴定磁性纳米颗粒是否成功标记BMSCs，以及标记后BMSCs细胞的活性和分化能力的方法总结如下。

2.3.1磁性纳米颗粒成功标记BMSCs的鉴定方法

2.3.1.1普鲁士蓝铁染色 成功标记的细胞内部可看到蓝染颗粒，标记率=蓝染细胞数/细胞总数。张旭等[17]发现，磁性纳米颗粒进入BMSCs后主要积聚于细胞质中，可见大量蓝染颗粒，部分聚集成团，颗粒分布以核周和靠近细胞膜处较为明显，细胞核中没有蓝染颗粒。

2.3.1.2透射电镜检查 以正常的BMSCs作为对照，成功标记的BMSCs细胞质中可观察到高密度电子颗粒，进入的纳米颗粒越多，高密度颗粒数量越多。

2.3.2磁性纳米颗粒-BMSCs生长活性的鉴定方法

2.3.2.1台盼蓝染色法 将纳米颗粒-BMSCs的细胞悬液与台盼蓝染色液以9∶1的比例混匀，静置3 min，光镜下计数，死细胞为蓝色，活细胞不着色，以正常的BMSCs作为对照，计数200个细胞，计算活细胞百分比。

2.3.2.2细胞计数试剂盒(CCK-8)法 将标记磁性纳米颗粒的BMSCs制成细胞悬液，外加正常细胞的空白对照组，按每孔100 μl接种于两块96孔板中，每组每天3个复孔。培养24 h后第1天测量组每孔加入10 μl CCK-8溶液，将培养板放入细胞培养箱中继续培养，测量标本450 nm处的吸光度值(A值)。根据公式：细胞抑制率=(A实验组-A阴性对照组)/(A实验组-A空白对照组)×100%，计算纳米颗粒对细胞的抑制率。

2.3.2.3测量生化指标法 乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶，主要存在于机体所有组织细胞的胞质内，当细胞膜的完整性受到破坏时，胞浆内的乳酸脱氢酶会溢出，因此测定上清液中的乳酸脱氢酶活性可以很好地反映细胞膜受损伤的程度，与细胞死亡数目成正比[21]。另外，也可测量超氧化物歧化酶(SOD)的含量来判断细胞的活力。超氧阴离子自由基是生物体内正常的代谢产物，SOD的主要功能是催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢和氧，可清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受伤害，因此SOD值可反映细胞抵抗氧化损伤的能力[22]。

2.3.2.4四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法[8，15，17，23]将纳米颗粒标记的BMSCs的细胞悬液接种于96孔板，以未标记的BMSCs作为空白对照，用酶标仪在490 nm处侧出A值，并与对照组对比。

2.3.3磁性纳米颗粒-BMSCs分化能力的鉴定方法

2.3.3.1茜素红染色法[23]在纳米颗粒-BMSCs组和正常BMSCs组中均加入成骨诱导液，观察细胞形态的变化，分化的细胞中间可见圆形与卵圆形钙化结节，茜素红染色可见桔红色钙盐沉积。

2.3.3.2测定BMSCs细胞上清液中的碱性磷酸酶活性 对不同时间段纳米颗粒-BMSCs组和正常BMSCs组上清液按碱性磷酸酶检测试剂盒操作说明进行酶联免疫检测，测定A值，计算两者差异有无统计学意义。

3 摄取有磁性纳米材料BMSCs的临床应用

3.1 骨骼系统

3.1.1椎间盘突出

Sakai等[24]用绿色荧光蛋白标记的自体BMSCs移植入成年家兔退变髓核中，结果显示，植入的细胞可以增辅并且表达出一些髓核细胞的特征性表型，髓核内蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达水平明显上调，两者均为细胞外基质的重要组成成分。Zhang等[25]将兔同种异体的BMSCs注射入兔的椎间盘，与未注射组和注射盐水组在1、3、6个月时分别检测mRNA、蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量，结果显示注射BMSCs组均明显增加。鲍军平等[12]以家兔为实验对象，证实BMSCs对椎间盘尚未突出但髓核已改变的椎间盘同样有效。

3.1.2股骨头坏死(ONFH)

ONFH是骨科常见难治性疾病，早期多用药物和物理治疗，晚期以人工关节置换为主，患者病程长、痛苦多、医疗花费大。BMSCs具有多向分化能力，移植入体内的BMSCs分化后可替换已经坏死的细胞，这为ONFH的治疗提供了一种全新的思路和方法。在ONFH病例中，BMSCs的数量及成骨活性均有明显的下降[26]。对116例坏死的股骨头行髓芯减压，同时抽取自体骨髓血，体外分离、浓集后植入骨坏死区域，即通过细胞移植治疗ONFH，对早期ONFH取得优良效果[27]。孟增东等[13]证实了SPIO标记的BMSCs与未标记的BMSCs原位移植治疗兔ONFH有着同样疗效。

3.2 肝脏

BMSCs在肝细胞生长因子的诱导下可以分化为正常肝细胞，已有报道将自体移植的BMSCs用于重型肝炎和晚期肝硬化的治疗，取得了良好效果。于春鹏[6]用PLL标记的磁性纳米颗粒-BMSCs，通过MRI观察BMSCs在大鼠肝纤维化模型中的定位情况，证实了BMSCs在大鼠体内可分化为肝细胞，同时为BMSCs的增殖分化提供了影像学支持。

3.3 其他疾病

张瑞平等[14]证实BMSCs移植对家兔急性重症胰腺炎(SAP)有一定治疗效果，同时通过MRI进行了细胞示踪，为SAP提供了一种新的治疗思路和方法。另外，使用不同的磁性纳米颗粒标记BMSCs，将标记细胞移植到梗死的心肌内进行MRI在体内显像的研究，证明标记细胞可以在常规心脏显影，并与组织学检查有良好的一致性[15]。这表明BMSCs在体内可以迁移到心脏，至于是否能顺利分化为心肌细胞，什么时候分化，需要什么条件，未见相关研究报道。有研究证实BMSCs可改善足细胞融合，促进足细胞再生，理论上为治疗糖尿病肾病提供了一种新的手段[28]。

4 存在的问题和未来的研究趋势

BMSCs的研究已经持续了30多年，在成功标记磁性纳米材料后，通过外加磁场和MRI技术的应用，BMSCs的靶向定位和体内的迁移、示踪等问题迎刃而解，实现了对BMSCs的动态观察。纳米材料的引入为BMSCs研究带来了飞跃性发展，但同时也有很多问题仍待解决：(1) 该研究仍处于动物试验阶段，缺乏人体试验的数据，应用于临床尚需时日；(2) 相关的机制和作用过程仍不清楚，例如纳米颗粒进入BMSCs的具体过程和作用机理，BMSCs在体内的定向迁移和分化，以及如何人为控制细胞分化的过程和结果等；(3) 进入机体后，BMSCs的自行分化问题；(4) BMSCs中的磁性纳米颗粒随着细胞的分裂逐渐减少，渐渐失去靶向性和定位能力，影响长期观察[24]；(5) 引入磁场后，正常的生理活动是否会受影响。

未来的研究重点是BMSCs的分化过程和机制，具体的分化时机和结果，若能实现人为控制，将是向临床应用迈出的重要一步。另外，要找到合适的方法，提高磁性纳米颗粒对BMSCs的封装效率，满足可以作为长期定位和示踪的要求。同时要引入外加磁场，观察外磁场对纳米颗粒对BMSCs的颗粒摄取、迁移、分化等行为有何影响，为将来细胞的靶向定位打下坚实基础。

5 总结和展望

医学科学研究的最终目的是应用于临床治疗。BMSCs具有多向分化的潜能，是组织工程学的重要种子细胞；磁性纳米材料的出现，是生物材料领域的重大突破；将磁性纳米材料封装入BMSCs，可以充分发挥两者的优势，具有广阔的发展前景。目前该项研究尚有一些问题需要解决和优化。可以预见，不远的将来，封装有磁性纳米颗粒的BMSCs将会大大促进组织工程学和临床医学的发展，为广大患者带来福利。

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2015-04-25

2015-05-17

国家大学生创新训练计划项目(1310286090)

曹国瑞(1989-)，男，河南洛阳人，在读本科生。E-mail:825118087@qq.com

周昕 E-mail:zhou_xin@126.com

曹国瑞，计中青，朱舟婷，等.磁性纳米材料对骨髓间充质干细胞行为影响的研究进展[J].东南大学学报：医学版，2015，34(5)：817-821．

R329.2

A

1671-6264(2015)05-0817-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.030