转铁蛋白水平与男性生育及睾丸足细胞功能的关系

杨 铮，黄 萍，彭道荣，郑善銮，张小宁，王 菁

（第四军医大学：1.学员旅；2.秦都口腔医院检验科；3.西京医院全军临床检验医学研究所，陕西 西安 710032）

转铁蛋白水平与男性生育及睾丸足细胞功能的关系

杨 铮1，黄 萍2△#，彭道荣3，郑善銮3，张小宁3，王 菁3

（第四军医大学：1.学员旅；2.秦都口腔医院检验科；3.西京医院全军临床检验医学研究所，陕西 西安 710032）

目的探讨转铁蛋白（Tf）水平与男性生育及睾丸足细胞功能的关系。方法收集临床男性不育症患者和正常生育者的精液标本，采用精子质量分析仪进行精子密度及活动率分析，并检测精液Tf水平；无菌切取大鼠睾丸，经胶原酶及透明质酸酶消化，分离出纯度较高的足细胞并培养，测定细胞培养液Tf水平；Tf水平测定均采用免疫速率散射比浊法。结果男性不育症患者精液Tf水平［（15±5）μmol/L］低于正常生育者［（24.5±6.5）μmol/L，P＜0.01］，而且与精子密度和活动率呈正相关（P＜0.01）。正常生育组大鼠睾丸足细胞悬液Tf水平［（25±8）μmol/L］高于不育组［（15±6）μmol/L，P＜0.01］。结论精液Tf水平的测定可作为反映足细胞功能，评价曲细精管生精功能及精子质量的指标，对男性不育症的诊断、治疗具有重要的价值。

精液； 转铁蛋白； 足细胞； 男性不育症

睾丸足细胞核均匀地分布在小鼠曲细精管中，而足细胞质与细胞膜以玫瑰花型与曲细精管基底部的干细胞相连，对生殖细胞起营养、支持及保护作用，能分泌多种物质参与生殖过程。目前已知大鼠和人睾丸转铁蛋白（Tf）是足细胞合成的主要蛋白，对促卵泡激素及睾酮等调节精子发生的激素调控起重要作用，铁的转运可能是足细胞的一种重要功能且与精子发生的激素调控有关。目前，只有精液中雄激素结合蛋白（ABP）的水平可以作为反映足细胞功能的特异性指标，但测定ABP繁琐费时，其在精液中的水平很低。有学者认为Tf水平可作为判断睾丸足细胞功能的指标，对了解睾丸曲细精管内的生精细胞有重要价值［1－2］。为此，笔者对临床140例精液样品中的Tf水平及精子活力、密度等进行了检测，分析了其与男性生育的关系，并对大鼠睾丸足细胞Tf分泌进行了初步研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取于西京医院泌尿外科、中医科门诊就诊的男性不育症患者110例作为不育组，纳入者均已婚并同居2年以上，性生活正常，排除女方不孕原因，年龄22～28（24±3）岁；另外选取有生育能力且自愿献精的男性30例作为正常生育组，年龄21～28岁，平均（24±3）岁。

1.2 试剂与仪器 试剂和耗材主要有DMEM－Ham′sF12培养液（美国Sigma公司生产），253U/mg的Ⅱ型胶原酶，890 U/mg透明质酸酶，10cm×10cm培养皿和24孔培养板（北京知麟堂生物科技发展有限公司产）；主要仪器包括SQA－V全自动精子质量分析仪（以色列产）；贝克曼Array360特种蛋白分析仪（美国产）。

1.3 方法

1.3.1 精液采集 所有受试者禁欲3～5d，用新洁尔灭消毒手及尿道口，以手淫法获取1次全部精液，放入一次性无菌干燥带盖塑料容器内，置37℃恒温水浴箱中，孵育30min，待完全液化后，进行精液分析及Tf水平测定。

1.3.2 精液分析 取液化的精液，参照WHO标准［3］，于SQA－V全自动精子质量分析仪检测。然后将不育男性按精子密度不同分为：无精子、＜2×1010/L、（2～4）×1010/L和＞4× 1010/L组共4组，各组分别为20、28、33、29例；按精子活动率分为：无活动力、＜20%、20%～40%和＞40%组，4组分别为21、30、30、29例；生育男性精子密度为（5～10）×1010/L，精子活动率为60%～90%，同时测定其各组精液Tf水平。

1.3.3 各组精液标本Tf水平的检测 采用聚乙烯二醇（PEG）兔抗人Tf血清与待测精液结合，使精液中的Tf发生特异性抗原抗体反应，形成极细的乳白色抗原抗体复合物颗粒，悬浮于溶液中，利用散射比浊原理，与标准浓度管相比较，求得精液中的Tf水平。具体操作步骤：取精液50μL，加入20 mmol/L PBS 450μL（1∶9稀释），混匀，于美国贝克曼Array360特定蛋白分析仪上选用尿液Tf测定应用程序，双管平行测定。

1.3.4 足细胞的分离、培养及实验 参照文献［4］取20d日龄，体质量约40g的雄性大鼠13只（第四军医大学动物中心提供），作为正常生育组。颈椎脱臼处死，无菌切取睾丸，用培养液冲洗3次，剥去白膜，剪碎放入试管中，每只加入158.37 nkat胶原酶和13.17nkat的透明质酸酶，37℃水浴震荡，消化15min，每隔5min用吸管轻轻吹打一次，然后静置5min；弃上层细胞悬液，剩下的细胞用培养液洗3次，每次1 500r/min离心10min。然后每只加入31.67nkat胶原酶和2.67nkat透明质酸酶，37℃水浴震荡，消化40min，每5min用吸管轻轻吹打一次；200目滤网过滤，滤液静置5min，去除部分漂浮细胞，1 500r/min离心10min×3次备用。经24h培养在倒置显微镜下观察细胞完全贴壁，呈多角形或梭形展开，多数细胞连成片，为典型的足细胞，细胞纯度高达93%以上，与文献［4］基本相同。取足细胞悬液，调细胞浓度为8×105/mL，加入24孔培养板中，置37℃孵箱48h后，测定上清液中的Tf水平。再选雄性大鼠13只采用腺嘌呤500mg/kg灌胃15d制作大鼠不育动物模型［5］作为不育组按上述方法分离、培养足细胞，测定细胞上清液中的Tf水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS统计软件进行统计分析，计量资料以表示，组间比较采用t检验，相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同精子密度组Tf水平的测定 正常生育组精液Tf水平与精子密度呈正相关（r＝0.91，P＜0.01），不育组各组（无精子、＜2×1010/L、（2～4）×1010/L和＞4×1010/L组）的精子密度与Tf呈正相关（r分别为0.45、0.69、0.73、0.89，P＜0.01），不育各精子密度组Tf水平随精子密度增加而上升，见表1。

表1 精子密度与精液Tf水平间的关系（）

＊：P＜0.01，与正常生育组比较。

组别 精子密度 n 精液Tf（μmol/L）L 30 25±6不育组 无精子 20 10±3＊＜2×1010/L 28 13±4＊（2～4）×1010/L 33 16±6＊＞4×1010/L 29 19±7正常生育组 （5～10）×1010/＊

2.2 不同精子活动率组Tf水平的测定 正常生育组和不育组各亚组（按精子活动率分为：无活动力、＜20%、20%～40%和＞40%组）精子活动率与精液Tf水平呈正相关（r分别为0.96、0.46、0.67、0.73、0.88，P＜0.01），不育组各亚组Tf水平随精子活动率增加而上升，见表2。

2.3 大鼠睾丸足细胞分泌Tf的水平与生育的关系 正常生育组大鼠睾丸足细胞细胞悬液中Tf的水平［（25±8）μmol/L］明显高于不育组大鼠睾丸足细胞细胞悬液［（15±6）μmol/L］，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

表2 不同精子活动率与Tf水平间的关系（）

＊：P＜0.01，与正常生育组比较。

组别 精子活动率 n 精液Tf（μmol/L）正常生育组 60%～90% 30 24±7不育组 无活动力 21 11±2＊＜20% 30 14±4＊20%～40% 30 16±5＊＞40% 29 19±6＊

3 讨 论

睾丸足细胞在精子发生过程中发挥着至关重要的作用，是曲精小管中唯一的非生殖细胞，不仅对生殖细胞发育起支持和营养作用，而且通过形成血－睾屏障决定并保持睾丸液的组分，还能传递支配精子发生的激素信号。足细胞能分泌多种对精子发生起重要作用的蛋白质，Tf就是睾丸足细胞产生和分泌的，Tf是由β1球蛋白与血中细胞生长的基本因子－－铁离子结合的一种复合体，是通过足细胞膜上Tf受体，以Tf的形式将铁储存于足细胞内，足细胞以顶端分泌的形式将铁传送给曲细精管生殖上皮上的不同发育时期的生精细胞，以促进生殖细胞的生长发育、成熟及释放过程起关键性的作用［6－8］。精液中80%的Tf是由足细胞分泌，Tf的主要功能为铁的转运载体，睾丸足细胞功能缺陷都会影响Tf的分泌导致精子的发生障碍，而影响生育能力，Tf水平的高低是反应足细胞功能的特定性标志［4］。当精液中Tf水平减少可直接影响精子细胞的形成和释放。Tf水平和精子总数呈正相关［9－10］。本研究显示，精液Tf水平与精子密度、活动率存在相关性，不育各组精液Tf水平随精子密度及活动率减低而下降，与正常生育组比较差异有统计学意义（P＜0.01），这说明精液Tf对精子的生长、发育、排放发挥着重要的作用。正常生育大鼠足细胞培养上清液Tf水平明显高于不育组（P＜0.01），这也说明了Tf水平测定对男性不育症有重要的诊断价值。

精子的顺利产生必须以足细胞功能正常为前提，而足细胞的功能则通过它所表达或分泌的各类蛋白来执行，蛋白的数量、构象发生改变会影响足细胞的功能。Tf水平是反映睾丸足细胞功能的指标之一，是评价曲细精管生精状态的一种特异性指标。精子的生成、成熟、运输及附性腺异常导致的精液和精子异常是男性不育症的最常见原因。临床上少精子症与弱精子症导致的男性不育症约占70%，精子数量、质量的变化是判断男性生育力的重要依据。由于Tf水平与精子密度、数量、质量呈正相关，所以检测精液中Tf水平对男性不育症的诊断和治疗具有一定的指导意义。

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Relationship between transferrin levels and function of male fertility and testicular podocyte

Yang Zheng1，Huang Ping2△#，Peng Daorong3，Zheng Shanluan3，Zhang Xiaoning3，Wang Jing3
（1.Student Brigade；2.Department of Clinical Laboratory，Qindu Stomatology Hospital；3.Clinical Laboratory Institute of PLA，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi′an，Shaanxi，710032）

ObjectiveTo investigate the relationship between levels of transferring（Tf）and function of male fertility and testicular podocyte.MethodsSemen samples from male patients with infertility and volunteers with normal infertility were collected and tested for sperm density and motility by using sperm quality analyzer.In additon to that，Tf concentrations of Tf were determined；aseptically excised rat testis and by collagenase and hyaluronidase digestion，podocytes were isolated with high purity and cultured in culture medium，then the concentration of Tf in cell culture medium was determined；Tf concentration were determined by rate nephelometry.ResultsTf concentration in semen of male－infertility patients［（15±5）μmol/L］was significantly lower than that of normal－fertility volunteers［（24.5±6.5）μmol/L，P＜0.01］，which were positively correlated sperm count and motility（P＜0.01）.Tf concentrations of cell culture medium［（25±8）μmol/L］in which testicular podocytes were cultured were significantly higher than that of infertile rat［（15±6）μmol/L，P＜0.01］.ConclusionDetermination of semen Tf levels can reflect podocyte function and be used as an indicator for the evaluation of seminiferous tubules spermatogenesis，which was valuable in the diagnosis and treatment of male infertility.

semen； transferrin； podocyte； male infertility

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.021

A

1673－4130（2015）03－0336－03

2013－11－18）

杨铮，女，在读本科生，主要从事从事医学生物学研究。#共同第一作者。△

，E－mail：huangping＠fmmu.edu.cn。