PEI与脂质体介导基因转染的比较研究

曹慧玲，滕凤猛，汪小蓉，顾万建，张春兵

（江苏省中医院/南京中医药大学附属医院检验科，江苏 南京 210029）

PEI与脂质体介导基因转染的比较研究

曹慧玲，滕凤猛，汪小蓉，顾万建，张春兵

（江苏省中医院/南京中医药大学附属医院检验科，江苏 南京 210029）

目的比较新型转染试剂阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）与脂质体2000介导的血管内皮细胞生长因子VEGF165基因转染人胚肾细胞293T的转染效率，为基因转染提供新的方法。方法分别采用脂质体和不同N/P比值的PEI将合成的含有绿色荧光蛋白（GFP）和VEGF165的质粒转入293T细胞。转染24h后，采用CCK－8试剂盒检测细胞活性；转染48h后在荧光显微镜下观察比较两种转染方法的转染效率，并通过ELISA方法检测细胞上清液中VEGF165浓度，比较两种方法的转染效果。结果当N/P＝9时，PEI转染的细胞活性与脂质体转染相近，对细胞的毒性较小；此时，PEI转染效率与脂质体也相似，均可达到约70%；同样，转染后细胞上清中VEGF165浓度较未转染组提高（P＜0.05），但两种方法转染组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论PEI作为一种新型的转染试剂，与脂质体相比，在一定比例范围内，具有转染效率高，对细胞毒性小且价格低廉的优势，有望成为基因转染的有效载体。

聚乙烯亚胺； 脂质体； 基因转染； 转染效率

基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送至细胞内。目前，应用最广泛的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们容易通过细胞膜，在通过细胞屏障方面跟病毒有很相似的特征。阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，应用也最为广泛。然而在体内，它会被迅速清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，具有毒性，这使其应用受到限制。由于阳离子脂质体使用的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到关注，聚乙烯亚胺（PEI）就是这样一类转染试剂［1］。PEI中的N元素与质粒DNA中P元素的摩尔数的比值（N/P比值）是影响PEI转染效率的重要因素。本研究旨在观察不同N/P比值PEI的转染效率及其对细胞活性的影响并与脂质体转染试剂进行比较，从而为扩大其应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 293T细胞由南京医科大学惠赠。PEI分支型，相对分子质量为25×103，为Sigma公司产品；脂质体2000为Invitrogen公司产品；VEGF165质粒［携带绿色荧光蛋白（GFP）基因］，由本实验室构建，见图1；CCK－8试剂盒为日本同仁公司生产；高糖DMEM培养液为Hyclone公司生产；胎牛血清为Hyclone公司生产；胰蛋白酶为Sigma公司生产；VEGF165 ELISA试剂盒为R＆D公司生产；PBS缓冲液购自南京天为公司。

1.2 方法

1.2.1 脂质体转染混合液配制 取无血清DMEM 100μL，加入质粒DNA 8μg，室温放置5min，取10μL脂质体2000加入无血清DMEM 100μL，放置5min，将二者混合后放置20 min，备用。

1.2.2 PEI转染混合液配制 取无血清DMEM 100μL，加入质粒DNA 8μg，放置5min，另根据不同N/P比值将PEI稀释至不同质量浓度，加入无血清DMEM 100μL中，放置5min，将两者混合，边加入边震荡，混合后放置20min，备用。

1.2.3 N/P比值的优化 本实验所用DNA质量为8μg，根据公式：N/P＝PEI（μg）/DNA（μg）×7.75进行计算，所需PEI的质量见表1。

1.2.4 细胞培养 293T细胞培养于DMEM［含10%胎牛血清（FBS）中］，置于37℃、5%CO2条件下连续培养，转染前24 h将细胞接种于6孔板中，每孔5×105个细胞且均匀分布，用于转染。

1.2.5 293T细胞转染 取6孔板细胞，PBS缓冲液洗涤两次，转染组细胞分别加入脂质体转染混合液和PEI转染混合液，对照组加入等量无血清DMEM，边加边混匀，37℃，5% CO2培养6h。转染后去除转染混合液，每孔加入完全培养基2mL继续培养，48h后检测转染效果。

1.2.6 细胞活性检测 采用CCK－8试剂盒进行检测。取转染48h的细胞接种于96孔板，培养过夜后，每孔加入CCK－8检测试剂10μL，37℃孵育4h，酶标仪检测吸光度（A）值。

1.2.7 转染后绿色荧光观察 在荧光显微镜下观察转染48h后带有绿色荧光的细胞比例，有绿色荧光说明转染成功。

1.2.8 ELISA检测培养上清VEGF165 取转染48h后细胞培养上清，按照VEGF165ELISA试剂盒说明书操作，得到培养上清中VEGF165的浓度。

1.3 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行统计分析，计量资料以表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞活性检测 PEI转染组细胞活性随N/P比值的升高而降低，N/P＝9时接近脂质体转染组，而所有转染组细胞较未转染组细胞活性均有所降低，但除N/P＝11时外，其他N/P比值的PEI转染与脂质体转染的差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.2 细胞转染效率 荧光显微镜观察到未转染组未见绿色荧光蛋白表达（转染率为0%），脂质体转染组可见大部分细胞表达绿色荧光蛋白（转染率约为70%），PEI转染组也可见大量细胞表达GFP（转染率约为75%），可见两种转染试剂均能达到较高的转染效率，见附图1（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。

2.3 细胞上清液VEGF165的浓度 转染48h后，ELISA法检测细胞上清液中VEGF165的浓度，见表3。VEGF165的浓度随N/P比值的增高而增加，当N/P＝9时，PEI转染结果与脂质体相似，较未转染组有明显升高（P＜0.01）。

表2 各组的细胞活性检测结果（pg/mL，）

＊：P＜0.05，与脂质体转染组比较；－：无数据。

检测结果PEI转染组分组－N/P＝0 3.28±0.34 N/P＝1 3.21±0.32 N/P＝3 3.15±0.27 N/P＝5 3.01±0.28 N/P＝7 2.93±0.22 N/P＝9 2.87±0.25 N/P＝11 2.24±0.30＊脂质体转染组 2.89±0.28未转染组3.29±0.36

）表3 细胞上清液中VEGF165的检测（pg/mL，

－：无数据。

分组 VEGF165水平PEI转染组 －N/P＝0 5.8±0.46 N/P＝1 9.2±0.11 N/P＝3 23.7±2.34 N/P＝5 67.9±5.53 N/P＝7 147.1±8.24 N/P＝9 241.5±14.76 N/P＝11 235.0±17.55脂质体转染组 240.3±16.65未转染组6.1±0.54

3 讨 论

PEI是人工合成的含有极高密度正电荷的有机大分子阳离子聚合物。PEI与DNA通过正负电荷的相互吸引形成复合物［2］，是较为有效的聚阳离子型基因载体，转染效率高，常辅助超声等物理方法携带外源基因进入目的细胞［3－4］。然而，随着PEI用量的增大，其细胞毒性也随之升高。同样，应用最多的脂质体转染方法与PEI转染有着相似的特性。但脂质体往往价格较高，相比较而言，PEI价格较低，在适当的比例下，也可发挥较好的转染效果［5］。

胡伟等［6］比较了PEI与阳离子脂质体转染人舌鳞癌细胞的转染效率和细胞毒性，研究发现在各自最佳转染条件下，PEI转染效率更高，细胞毒性小。为了进一步了解PEI作为新型转染试剂的优势，本研究以293T作为转染细胞，通过观察质粒载体上GFP和VEGF165的表达情况，比较了脂质体、PEI两种转染试剂的转染效率。细胞活性检测结果显示，较未转染细胞的细胞活性而言，经过转染的细胞活性均有所降低，且随着N/P比值的增加PEI对细胞的毒性也逐渐加大。但是当PEI控制在一定范围内，与未转染组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。同时，研究表明当PEI浓度为N/P＝9时，对细胞活性的影响与脂质体转染方法接近，说明在一定比例范围内，PEI毒性对细胞活性的影响不大。荧光显微镜观察细胞转染结果显示，两种转染方法的转染效率均达到70%（产生绿色荧光的细胞即转染阳性细胞占总细胞的比例），与脂质体相比，一定N/P比值的PEI转染同样具有较好转染效果。携带VEGF165基因的质粒转染入293T细胞，培养后转染细胞可表达VEGF165相应蛋白，并分泌入细胞上清中，使得细胞上清中VEGF165的含量增加，增加程度与荧光结果相一致。本研究显示，加入适当N/P比值的PEI后，两种方法转染后细胞上清液中的VEGF165水平与未转染组比较，均显著提高，再次验证了PEI与脂质体转染具有较高的转染效率，且转染效果相似。

目前，PEI及其相关复合试剂广泛应用于医学的各个领域［7］，Liang等［8］认为PEI与普流尼克通过表面交联可以达到更好的转染效果；Shao等［9］学者则利用PEI包裹病毒样颗粒介导isRNA用于治疗乳腺癌研究；Liu等［10］利用PEI－PEG将DNA及药物特异性导入肿瘤细胞；傅晓源等［11］制备了PEI载基因纳米颗粒并研究其理化性质及体外活性。本文的研究也提示，在适合的比例下PEI可以替代脂质体，作为新型有效的转染试剂用于实验研究中。

PEI作为新型转染试剂，其细胞毒性一定程度上制约了其的应用，因此，有更多的研究者提出对PEI的加入量加以控制（N/P比值）或对其进行重新构建，以减少其对细胞活性的影响［12］。

综上所述，通过比较阳性聚合物PEI与脂质体2000两种转染试剂分别介导VEGF165质粒的转染效率，说明PEI在适当的N/P比值时，可以达到与脂质体同样或更好的转染效果，如将PEI加以改造，构建新的复合转染试剂，可有效降低PEI的生物毒性，使其应用更为广泛。由于PEI较脂质体而言具有转染效率高且经济实惠的优势，提示其可作为新型的转染试剂广泛应用于医疗领域。

［1］Yan X，Zhang Y，Zhang H，et al.Amphiphilic polyethylenimine（PEI）as highly efficient non－viral gene carrier［J］.Org Biomol Chem，2014，12（12）：1975－1982.

［2］刘涛，马栋，王蓉，等.叶酸靶向PEG－PEI－Alg－氧化铁磁性纳米基因载体的构建及鉴定［J］.中国现代医学杂志，2012，22（19）：12－17.

［3］陈智毅，谢明星，王新房，等.超声辐照联合PEI增强体外基因转染的实验研究［J］.中国超声医学杂志，2009，25（1）：1－4.

［4］Chen XA，Zhang LJ，He ZJ，et al.Plasmid－encapsulated polyethylene glycol－grafted polyethylenimine nanoparticles for gene delivery into rat mesenchymal stem cells［J］.Int J Nanomedicine，2011，6（6）：843－853.

［5］Opanasopit P，Paecharoenchai O，Rojanarata T，et al.Type and composition of surfactants mediating gene transfection of polyethylenimine－coated liposomes［J］.Int J Nanomedicine，2011，6（7）：975－983.

［6］ 韩伟，胡勤刚，王志勇，等.两种转染方法介导质粒转染人舌鳞癌细胞的实验研究［J］.实用口腔医学杂志，2008，24（4）：575－578.

［7］彭健，刘桦，刘路，等.PEG－PEI/Fe3O4纳米磁流体－TK对裸鼠移植性肝癌细胞靶向杀伤作用研究［J］.中国现代医学杂志，2008，18（9）：1162－1166.

［8］Liang W，Gong H，Yin D，et al.High－molecular－weight polyethyleneimine conjuncted pluronic for gene transfer agents［J］.Chem Pharm Bull（Tokyo），2011，59（9）：1094－1101.

［9］Shao W，Paul A，Abbasi S，et al.A novel polyethyleneimine－coated adeno－associated virus－like particle formulation for efficient siRNA delivery in breast Cancer therapy：preparation and in vitro analysis［J］.Int J Nanomedicine，2012，7（9）：1575－1586.

［10］Liu C，Liu F，Feng L，et al.The targeted co－delivery of DNA and doxorubicin to tumor cells via multifunctional PEI－PEG based nanoparticles［J］.Biomaterials，2013，34（10）：2547－2564.

［11］傅晓源，张浩伟，谢灏，等.聚乙烯亚胺载基因纳米颗粒的制备及其相关特性的研究［J］.中国现代医学杂志，2008，18（24）：3570－3572.

［12］Huang X，Hartley AV，Yin Y，et al.AAV2production with optimized N/P ratio and PEI－mediated transfection results in low toxicity and high titer for in vitro and in vivo applications［J］.J Virol Methods，2013，193（2）：270－277.

Comparison of gene transfection reagents between PEI and lipofectamine

Cao Huiling，Teng Fengmeng，Wang Xiaorong，Gu Wanjian，Zhang Chunbing
（Department of Clinical Laboratory，Jiangsu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine/Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu210029，China）

ObjectiveTo compare the transfection efficiency of cationic polyethylenimine（PEI）with Lipofectamine 2000TM by using the plasmid DNA encoding vascular endothelial cell growth factor（VEGF165）gene in human embryonic kidney cell line 293T.MethodsPEI of different N/P ratio and Lipofectamine 2000TM were used to deliver the vector containing VEGF165to 293Tcells，respectively.Green fluorescent protein（GFP）gene was inserted into the vector as a report gene.Evaluation of cytoactive was performed by CCK－8assay 24hafter transfection.The cells were observed by fluorescent microscope and the presence of VEGF165in cell supernatant was detected by ELISA 48hafter transfection.The transfection efficiency was calculated and compared.ResultsSimilar cytoactive and best transfection efficiency could be obtained when N/P ratio was 9，the transfection efficiency was around 70%.Furthermore，the presence of VEGF165increased significantly after transfection（P＜0.05），but there was no significant difference between the two groups in which different transfection methods were adopted.ConclusionPEI as a novel oligofectamine reagent could mediate more efficient transfection compared with lipofectamine.It also has low cell－toxicity and low price and could be an ideal vector in gene delivery technology.

polyethylenimine； lipofectamine； gene transfection； transfection efficiency

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.018

A

1673－4130（2015）03－0328－03

2014－12－08）

曹慧玲，女，主管检验技师，主要从事医学检验基础研究。