基因DNA甲基化在子痫前期中的研究进展

李涵，顾蔚蓉

·综述·

基因DNA甲基化在子痫前期中的研究进展

李涵，顾蔚蓉△

子痫前期是一种妊娠期特有的疾病，以高血压和蛋白尿为主要临床特征，同时可伴有全身多脏器损伤。由于其病因不明，除终止妊娠之外缺乏有效的临床治疗方法，因此，子痫前期是导致孕产妇死亡的主要原因之一。子痫前期的发病机制还未得到具体的阐述，近年来随着表观遗传学领域的发展，尤其是基因甲基化的研究，为子痫前期的诊断和治疗提供了一个新的视角。研究发现，异常的全基因组甲基化以及CpG岛甲基化与子痫前期中许多重要功能基因表达异常有关，推测其间接参与了子痫前期的发生。综述基因DNA甲基化在该疾病发生中的研究现状和研究进展综述。

先兆子痫；遗传现象；遗传学；DNA甲基化；滋养层；胎盘

【Abstract】Pre-eclampsia is a pregnancy-specific disease，which is chararized by hypertension and proteinuria，and may be accompanied by multiple organ damages.Because its etiology is unknown，and except for termination of pregnancy，there are no effective treatments，pre-eclampsia is the main cause of maternal mortality.The pathogenesis of pre-eclampsia has not been expounded.In recent years，the development of epigenetic，especially the study of DNA methylation，provides a new perspective for the diagnosis and treatment of preeclampsia.The study found that many important functional abnormalities of whole genome methylation and aberrant CpG island methylation related to gene expression in pre-eclampsia abnormalities，presumably occurs indirectly involved in pre-eclampsia.This paper summanizes of the research status and advances of gene DNA methylation in pre-eclampsia.

【Keywords】Pre-eclampsia；Genetic phenomena；Genetics；DNA methylation；Trophoblasts；Placenta

（J Int Obstet Gynecol，2015，42：69-72）

子痫前期是指妊娠20周后新出现的以高血压和蛋白尿为主要临床特征的产科并发症，同时也是最为常见的产科并发症之一。子痫前期可以导致严重的母体多系统损害和胎儿生长受限（FGR），同时也增加了围生儿不良结局的发生［1］。子痫前期的病因未明，其发病机制复杂，多数研究认为滋养细胞发育不良、胎盘血液灌注减少是子痫前期发病的根本原因。子痫前期是一组机体多因素与环境相互作用的疾病，单一的因素并不能完全解释其发生。

表观遗传学是在基因组DNA序列不发生变化的条件下，基因表达发生改变并导致可遗传的表现型变化。目前发现的表观遗传学调节主要包括DNA甲基化作用、组蛋白修饰作用、染色质重塑、基因印迹、小分子RNA调控等。在哺乳动物中，DNA甲基化由DNA甲基转移酶（DNMTs）催化，S腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶部位，将其甲基化为5-甲基胞嘧啶，最终导致转录抑制及表型改变。人类基因组约包含29000 个CpG岛，长度为500 bp左右，CG含量约为55％。DNA甲基化调控机制与细胞分化发育密切相关，调控细胞分化的关键基因发生异常甲基化可以导致各种疾病的发生。

子痫前期的发生与滋养细胞的异常增殖有关，异常增殖的滋养细胞侵入子宫的螺旋小动脉导致子宫肌层螺旋小动脉发生重铸不良，异常狭窄的螺旋动脉使得胎盘灌注减少和缺氧，最终导致子痫前期的发生。Ohgane等［2］报道滋养细胞分化与DNA甲基化及非甲基化状态有关。许多研究证实人类基因组中CpG岛的异常甲基化与相关基因沉默相关，滋养细胞分化过程中，一些基因启动子区CpG岛甲基化及非甲基化状态可以改变基因表达状态，继而影响滋养细胞生理功能来参与子痫前期的发病。同样，Wang等［3］研究发现辅助生殖技术的使用增加妇女罹患子痫前期的风险，这一研究也提示生殖细胞表观遗传学改变可以导致胎盘缺陷，参与子痫前期的发生。

1　子痫前期全基因组的甲基化

基因的DNA甲基化修饰改变主要表现为总体甲基化水平异常和个别基因启动子区甲基化水平的升高。研究证实在子痫前期患者的血清和胎盘中存在不同程度的全基因组甲基化改变。对子痫前期患者全血白细胞进行全基因组甲基化位点分析显示，全基因组甲基化水平高于正常妊娠妇女，其中甲基化异常的基因（GRIN2b、GABRA1、PCDHB7和BEX1）多数与癫痫的发生有关，他们与皮质的兴奋性和神经连接相关联［4］。类似的研究也在胎盘中展开，Blair等［5］同样利用全基因组甲基化位点分析结合焦磷酸盐测序技术发现：早发型子痫前期（EOPET）基因组甲基化谱与正常妊娠者不同，其中有差异的位点集中于基因组增强子区域，并且70％以上的位点呈低甲基化改变；进一步全基因表达谱分析发现，基因表达异常［如血管生成因子内皮性PAS蛋白1 （EPAS1）、Fms相关的酪氨酸激酶1（FLT1）］与其甲基化水平改变呈负相关。Kulkarni等［6］对87例妊娠妇女（30例子痫前期足月产，27例子痫前期早产，30例血压正常妊娠妇女足月产）的胎盘进行全基因组甲基化水平检测证实，子痫前期两组妊娠妇女胎盘甲基化水平较正常组显著升高，且升高的甲基化水平与子痫前期组妊娠妇女的血压（收缩压/舒张压）呈正相关。由于胎盘组织基因组甲基化谱受胎盘组织中不同细胞分布的影响，因此全面可靠的研究需要在大样本量的群体中进行，但是这并不影响全基因组甲基化谱的研究对以后相关基因甲基化研究的指导意义，全基因组的检测为子痫前期早期诊断提供了一个崭新的思路。

2　子痫前期相关基因的甲基化

2.1基质金属蛋白酶（MMP）抑制因子3（TIMP-3）与MMP-9TIMP-3是TIMPs家族成员，抑制MMPs降解细胞外基质的功能，在妊娠过程中调控滋养细胞浸润和子宫螺旋动脉重铸。Yuen等［7］对欧洲妊娠妇女EOPET、晚发型子痫前期（LOPET）、FGR以及正常妊娠妇女4组胎盘的1 505个CpG位点进行甲基化分析，EOPET组34个位点显著低甲基化，焦磷酸测序技术对其中4个低甲基化位点进行验证，TIMP-3启动子区呈现显著低甲基化，并且TIMP-3表达与基因甲基化水平呈负相关。Xiang等［8］在对中国汉族子痫前期患者胎盘的甲基化检测中也发现了相似的结果。

MMP-9与TIMP-3的表观遗传学调控类似，在子痫前期表达升高也与其基因启动子区甲基化有关，其启动子区-712位点DNA甲基化水平在子痫前期中显著降低［9］。MMPs与TIMPs作用密切相关，TIMPs是MMPs的天然抑制剂，两者的平衡在调控细胞侵袭功能中发挥重要作用，因此，不难推测TIMP-3、MMP-9表达异常导致的TIMP/MMP失衡可能是子痫前期发病的重要原因。

2.2丝氨酸蛋白酶抑制剂家族（SERPINs） SERPINs是体内重要的蛋白酶抑制剂，通过调控中和过度表达的丝氨酸蛋白酶活性参与炎症反应以及组织重建等过程。子痫前期胎盘丝氨酸蛋白酶抑制剂A3 （SERPINA3）和SERPINB5启动子区部分CpG位点甲基化水平降低，进一步生物信息分析发现，SERPINA3低甲基化的位点多为炎性相关因子MAZF、维甲酸X受体-α/过氧化物酶体增殖因子活化受体-γ（RXR-α/PPAR-γ）和缺氧诱导因子1α （HIF-1α）结合位点，而且转录因子RXR-α/PPAR-γ 及HIF-1α在妊娠早期与滋养细胞侵袭功能密切相关。启动子区甲基化水平的降低导致活性转录因子与染色质结合增多，并最终促进SERPINs的表达［10-11］。SERPINs表达升高能抑制弹性蛋白酶降解弹性蛋白、骨胶原、纤维连接蛋白、层黏连蛋白等，进而减少基质沉积，最终导致滋养细胞侵袭降低，发生不良妊娠。

2.3Syncytin-1Syncytin-1是人内源性逆转录病毒（HERV）家族HERVW编码的包膜蛋白，在胎盘组织高度表达。其是一种功能性融合蛋白，可以介导滋养细胞融合成合体滋养细胞。合体滋养细胞是母胎界面的主要分子，通过分泌人绒毛膜促性腺激素（hCG）和人胎盘泌乳素（HPL）维持正常的胎盘功能。

子痫前期胎盘病理特点之一为合体滋养细胞发育不良，Syncytin-1在子痫前期胎盘中表达降低。在子痫前期胎盘组织中 Syncytin-1的编码基因HERVW启动组区域平均甲基化水平高于正常妊娠组，同样的甲基化水平升高还发生于FGR、子痫前期合并FGR、HELLP综合征合并FGR［12］。DNA甲基化转移酶抑制剂5-aza处理不同来源的滋养细胞株，可以诱导Syncytin-1普遍升高并促进滋养细胞融合为合体滋养细胞的功能，进一步证实了Syncytin-1在子痫前期中表达异常受到表观遗传学机制——DNA甲基化的调控［13］。

2.4Ras相关区域家族1A（RASSF1A） RASSF1A 是2000年发现的新型候选抑癌基因。RASSF1A蛋白分子可以通过其非同源结构域与Ras效应蛋白Norel结合形成异源二聚体，再通过Norel与Ras相似的GTP酶相互作用，介导细胞生长的负调控效应。肿瘤细胞中，RASSF1A启动子区域呈现出高甲基化与RASSF1A的失活密切相关。

研究证实，RASSF1A在子痫前期胎盘中的甲基化升高并且在母血清中胎儿游离DNA中发生低甲基化改变［14］。但是，RASSF1A在子痫前期的具体机制未明。随着基因甲基化检测技术的发展，来自不同实验组的研究先后证实了RASSF1A在子痫前期的胎儿游离DNA中甲基化水平升高［15-16］。这提示血清胎儿游离DNA的甲基化检测可以为未来的无创产前诊断提供新的思路。

2.525-羟维生素-24-羟化酶（CYP24A1）

CYP24A1在子痫前期中高表达，可以增加灭活维生素D活性形式的1，25-（OH）2D，负向调控维生素D的代谢。维生素D缺乏与子痫前期发病有关，子痫前期患者胎盘组织CYP24A1甲基化水平明显降低，其表达产物24-羟化酶的表达量增加，从而减少维生素D的活性形式［17］。与此相反，有研究者利用维生素D缺乏诱导的大鼠模型研究CYP24A1的表观遗传学变化，并未发现CYP24A1在子痫前期的表达改变与基因甲基化相关［18］。尽管结论不尽相同，维生素D代谢在子痫前期中的异常代谢以及CYP24A1的甲基化调控机制是不可否认的。阐明这个问题还需要更为科学合理的实验研究。

2.6血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮生长因子受体（FLT-1）和含激酶插入区受体（KDR） VEGF在胎盘形成中发挥核心作用，调控胎盘中的血管生成以及血管再生的过程。VEGF主要通过两种高亲和性酪氨酸激酶受体——FLT-1和KDR发挥其生物学作用。VEGF及其受体调控异常被证实与子痫前期胎盘缺陷及内皮功能异常有关。FLT-1与VEGF相互作用，介导滋养细胞侵袭和假性血管生成过程；而KDR则主要负责调控血管细胞有丝分裂和血管形成的过程。最近，Sundrani等［19］同时分析了VEGF、FLT-1和KDR在子痫前期胎盘中的表达改变，并分别对不同组间的启动子CpG甲基化水平进行比较，发现VEGF/FLT-1/KDR基因启动子区域甲基化状态及其表达在子痫前期中呈现出独特的改变：病例组中，VEGF启动子区高甲基化水平与其表达降低相关；另外，FLT-1/KDR启动子区呈现出中等水平的甲基化，虽然较正常血压组没有显著改变，但是其FLT-1/KDR表达量明显升高。

3　子痫前期与应激反应相关基因甲基化的关系

母体的应激反应以及宫内高水平的糖皮质激素暴露被证明与低出生体质量儿有关，并增加其成年后发生心血管等疾病的风险。子痫前期中异常的病理生理改变极有可能触发机体应激反应，并与不良妊娠结局有关。在免疫等疾病研究中证实多数应激相关基因受DNA甲基化调控，妊娠妇女甲基供体叶酸摄入过多可以导致胎盘促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）基因高甲基化而抑制其表达，这提示子痫前期中应激相关基因可能与DNA甲基化有关。Hogg等［20］对子痫前期胎盘应激相关基因进行全面的分析，研究结果证实：糖皮质激素受体（NR31C1）、促肾上腺皮质素释放激素结合蛋白（CRHBP）相关CpG位点高甲基化改变伴随CRH相关位点低甲基化改变，而且糖皮质激素代谢中的关键分子3β羟基类固醇脱氢酶1（HSD3β1）等也发生了低甲基化，这些改变特异性地存在于子痫前期中，提示应激反应在子痫前期中的重要作用受DNA甲基化调控。

4　子痫前期与印迹基因甲基化的关系

在配子或合子发生期间，来自亲本的等位基因或染色体在发育过程中产生专一性的加工修饰，导致后代体细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达方式，称为遗传印迹。其是一种伴有基因组改变的非孟德尔遗传形式，发生此种改变的基因称为印迹基因。绝大多数印迹基因通过影响胚胎形成、滋养细胞生长以及胚胎发育等过程来调节机体生长发育。印迹基因仅当其表达的一方等位基因突变时，才会对子代基因型产生影响，导致了遗传性疾病的家族内部不一致遗传模式。因此，印迹基因在关于子痫前期的研究中备受重视。越来越多的证据显示子痫前期与胎儿基因突变和母系基因表达有关，推测子痫前期是一种父系印迹基因突变引起的疾病。

在人类胚胎中父系印迹基因H19高表达，调节胚胎生长发育以及细胞滋养细胞的分化，但其在人类生殖和胚胎发育中的作用很少被了解。Yu等［21］通过定量聚合酶链反应（PCR）技术针对妊娠不同时期、血压正常及子痫前期妊娠妇女的胎盘样本进行检测，比较不同组别H19基因型别、基因印迹以及印迹基因H19的mRNA含量，发现妊娠10周左右H19基因由双等位基因表达转变为单等位基因表达，并对维持妊娠具有重要作用，子痫前期患者中H19基因印迹消失者更倾向发生严重高血压。尽管如此，随后也有研究认为H19基因印迹控制区即胰岛素样生长因子2（IGF-2）基因印迹控制区（ICR1）低甲基化，仅与FGR而非子痫前期有关系，并提出ICR区低甲基化可能是胎盘形成异常所造成的FGR的结果而非原因［22］。2005年van Dijk等［23］指出荷兰人中位于10q22的STOX1基因与子痫前期的遗传性有关。van Dijk等［24］又于2010年的研究指出STOX1基因系父系印迹基因，STOX1基因印迹消失与滋养细胞侵袭性改变有关。印迹基因在子痫前期发病中的作用仍需探索，但其与胚胎发育调节及滋养细胞分化过程中的联系是毋庸置疑的。

5　展望

基因甲基化作为重要的分子遗传学机制参与滋养细胞功能调控，与子痫前期的发生发展密切相关。全基因组甲基化水平异常，子痫前期相关基因甲基化等都会促使子痫前期的发生及演进。随着DNA甲基化检测技术的发展，未来研究可以通过筛选子痫前期特异性基因甲基化改变，寻找新的生物学诊断指标；同时可以探索其甲基化异常相关功能基因上下游作用机制，进一步丰富子痫前期发病理论，并为该疾病的临床诊断及治疗提供新的靶点。

［1］Liu S，Joseph KS，Liston RM，et al.Incidence，risk factors，and associated complications of eclampsia［J］.Obstet Gynecol，2011，118 （5）：987-994.

［2］Ohgane J，Hattori N，Oda M，et al.Differentiation of trophoblast lineage is associated with DNA methylation and demethylation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，290（2）：701-706.

［3］Wang JX，Knottnerus AM，Schuit G，et al.Surgically obtained sperm，and risk of gestational hypertension and pre-eclampsia［J］.Lancet，2002，359（9307）：673-674.

［4］White WM，Brost B，Sun Z，et al.Genome-wide methylation profiling demonstrates hypermethylation in maternal leukocyte DNA in preeclamptic compared to normotensive pregnancies［J］.Hypertens Pregnancy，2013，32（3）：257-269.

［5］Blair JD，Yuen RK，Lim BK，et al.Widespread DNA hypomethylation at gene enhancer regions in placentas associated with early-onset pre-eclampsia［J］.Mol Hum Reprod，2013，19（10）：697-708.

［6］Kulkarni A，Chavan-Gautam P，Mehendale S，et al.Global DNA methylation patterns in placenta and its association with maternal hypertension in pre-eclampsia［J］.DNA Cell Biol，2011，30（2）：79-84.

［7］Yuen RK，Peñaherrera MS，von Dadelszen P，et al.DNA methylation profiling of human placentas reveals promoter hypomethylation of multiple genes in early-onset preeclampsia［J］.Eur J Hum Genet，2010，18（9）：1006-1012.

［8］Xiang Y，Zhang X，Li Q，et al.Promoter hypomethylation of TIMP3 is associated with pre-eclampsia in a Chinese population［J］.Mol Hum Reprod，2013，19（3）：153-159.

［9］Wang Z，Lu S，Liu C，et al.Expressional and epigenetic alterations of placental matrix metalloproteinase 9 in preeclampsia［J］.Gynecol Endocrinol，2010，26（2）：96-102.

［10］Chelbi ST，Wilson ML，Veillard AC，et al.Genetic and epigenetic mechanisms collaborate to control SERPINA3 expression and its association with placental diseases［J］.Hum Mol Genet，2012，21 （9）：1968-1978.

［11］Fournier T，Pavan L，Tarrade A，et al.The role of PPAR-gamma/ RXR-alpha heterodimers in the regulation of human trophoblast invasion［J］.Ann N Y Acad Sci，2002，973：26-30.

［12］Ruebner M，Strissel PL，Ekici AB，et al.Reduced syncytin-1 expression levels in placental syndromes correlates with epigenetic hypermethylation of the ERVW-1 promoter region［J］.PLoS One，2013，8（2）：e56145.

［13］Zhuang XW，Li J，Brost BC，et al.Decreased expression and altered methylation of syncytin-1 gene in human placentas associated with preeclampsia［J］.Curr Pharm Des，2014，20（11）：1796-1802.

［14］Chan KC，Ding C，Gerovassili A，et al.Hypermethylated RASSF1A in maternal plasma：A universal fetal DNA marker that improves the reliability of noninvasive prenatal diagnosis［J］.Clin Chem，2006，52 （12）：2211-2218.

［15］Bellido ML，Radpour R，Lapaire O，et al.MALDI-TOF mass array analysis of RASSF1A and SERPINB5 methylation patterns in human placenta and plasma［J］.Biol Reprod，2010，82（4）：745-750.

［16］White HE，Dent CL，Hall VJ，et al.Evaluation of a novel assay for detection of the fetal marker RASSF1A：facilitating improved diagnostic reliability of noninvasive prenatal diagnosis［J］.PLoS One，2012，7（9）：e45073.

［17］Novakovic B，Sibson M，Ng HK，et al.Placenta-specific methylation of the vitamin D 24-hydroxylase gene：implications for feedback autoregulation of active vitamin D levels at the fetomaternal interface［J］.J Biol Chem，2009，284（22）：14838-14848.

［18］Goyal R，Zhang L，Blood AB，et al.Characterization of an animal model of pregnancy-induced vitamin D deficiency due to metabolic gene dysregulation［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2014，306 （3）：E256-E266.

［19］Sundrani DP，Reddy US，Joshi AA，et al.Differential placental methylation and expression of VEGF，FLT-1 and KDR genes in human term and preterm preeclampsia［J］.Clin Epigenetics，2013，5 （1）：6.

［20］Hogg K，Blair JD，McFadden DE，et al.Early onset pre-eclampsia is associated with altered DNA methylation of cortisol-signalling and steroidogenic genes in the placenta［J］.PLoS One，2013，8（5）：e62969.

［21］Yu L，Chen M，Zhao D，et al.The H19 gene imprinting in normal pregnancy and pre-eclampsia［J］.Placenta，2009，30（5）：443-447.

［22］Bourque DK，Avila L，Peñaherrera M，et al.Decreased placental methylation at the H19/IGF2 imprinting control region is associated with normotensive intrauterine growth restriction but not preeclampsia［J］.Placenta，2010，31（3）：197-202.

［23］van Dijk M，Mulders J，Poutsma A，et al.Maternal segregation of the Dutch preeclampsia locus at 10q22 with a new member of the winged helix gene family［J］.Nat Genet，2005，37（5）：514-519.

［24］van Dijk M，Drewlo S，Oudejans CB.Differential methylation of STOX1 in human placenta［J］.Epigenetics，2010，5（8）：736-742.

Research Progress of DNA Gene Methylation in Patients with Pre-eclampsia

LI Han，GU Wei-rong.
Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University，Shanghai 200011，China

GU Wei-rong，E-mail：guweirong163@163.com

2014-08-09）

［本文编辑王昕］

200011上海，复旦大学附属妇产科医院通信作者：顾蔚蓉，E-mail：guweirong163@163.com

△审校者