Wangzaozin A调节NADPH氧化酶源性活性氧诱导HL-60细胞分化

丁 兰， 陈祎平， 刘国安， 吴炎鹏

(西北师范大学 生命科学学院， 兰州 730070)



Wangzaozin A调节NADPH氧化酶源性活性氧诱导HL-60细胞分化

丁 兰*， 陈祎平， 刘国安， 吴炎鹏

(西北师范大学 生命科学学院， 兰州 730070)

利用台盼蓝排染法、吉姆萨染色及流式细胞术对对映-贝壳杉烷二萜wangzaozin A影响人早幼粒白血病细胞HL-60生长、细胞形态、NBT还原能力、细胞吞噬及细胞表面抗原CD11b表达进行了检测.结果显示，0.2～0.8 μmol/L wangzaozin A抑制HL-60细胞生长，0.6和0.8 μmol/L处理组细胞显示了明显的G1期周期阻滞.随着wangzaozin A浓度升高及处理时间延长，细胞核质比减小，肾形核、杆状核和分叶核细胞增多及胞质中颗粒状物质增加；同时，细胞NBT还原能力、吞噬能力及细胞表面抗原CD11b表达显著增强，表明wangzaozin A可诱导HL-60细胞向成熟粒细胞分化.进一步利用荧光探针DCF检测显示0.6和0.8 μmol/L wangzaozin A处理细胞12 h后细胞内ROS显著升高；抗氧化剂NAC及NADPH氧化酶抑制剂APO显著抑制wangzaozin A诱导HL-60细胞上调CD11b表达，表明wangzaozin A可通过上调NADPH氧化酶源性的活性氧浓度诱导HL-60细胞分化.

wangzaozin A； HL-60细胞； 分化； 活性氧； NADPH氧化酶

急性髓性白血病(AML)主要源于细胞内多种造血转录因子的破坏，导致细胞分化受阻进而发展成为癌症[1].20世纪80年代，全反式维甲酸(ATRA)被成功用于急性早幼粒细胞白血病(APL，为AML的一种亚型)的临床分化治疗[2]，维甲酸类化合物成为APL临床分化治疗最具代表性的分化诱导剂，其诱导分化机制成为肿瘤分化治疗的前沿研究领域.研究证实，大多数APL具有特征性染色体t(15;17)易位，形成早幼粒细胞白血病基因和维甲酸受体α(RAR-α)基因的融合基因(PML-RARα)，该基因编码的融合蛋白阻止APL细胞分化和凋亡[3-4]；ATRA和As2O3均能靶向作用于APL融合蛋白PML-RARα，使之降解，进而诱导APL细胞分化和凋亡[5-6].ATRA的分化治疗及其与As2O3的联合治疗成为了APL治疗的成功范例.然而，临床治疗所伴随的ATRA综合症及耐药性等问题严重影响了分化治疗的疗效，因此，发现新的靶向分化诱导剂是解决耐药性、毒副作用及提升疗效的最佳途径.

香茶菜属植物的主要次生代谢产物对映-贝壳杉烷二萜已分离鉴定约500余种，其研究主要集中于植物化学成分及其分子结构确定，有关生物活性的报道较少但逐年增多，其中良好的抗癌活性引起了极大关注[7-9]，某些对映-贝壳杉烷型二萜被认为有望成为新的抗癌先导化合物[10].最近，该类化合物对不同类型的白血病细胞的靶向作用研究取得了重要进展：腺花素(adenanthin)直接靶向作用于过氧化氧化还原蛋白Ⅰ和Ⅱ，抑制其活性，通过升高急性早幼粒细胞白血病细胞NB4细胞活性氧浓度，激活相关信号通路，诱导NB4细胞分化[11]，并显示了对不同类型的白血病细胞的分化诱导作用[12]；川藏香茶菜甲素(pharicin A)可直接与纺锤体组装检点蛋白BubR1结合，干扰BubR1功能，诱导白血病Jurkat和Raji细胞阻滞于M期[13]；川藏香茶菜乙素(pharicin B)能迅速稳定多种AML细胞内的RAR-α蛋白，显著增强ATRA的分化诱导作用[14]；冬凌草甲素(oridonin)可与致癌蛋白AML1-ETO结合，使其产生截短的AML1-ETO，选择性地诱导t(8;21)白血病细胞凋亡[15].这些研究结果表明，不同分子骨架的对映-贝壳杉烷型二萜可多靶点作用于白血病细胞，诱导其分化及凋亡，契合了中医学的“多靶点效应”，充分显示了该类化合物对白血病分化治疗的潜在价值.然而迄今为止，对不同分子构型的对映-贝壳杉烷二萜的分化诱导机制的研究还极少.本课题组对一种C-20位未氧化型对映-贝壳杉烷二萜wangzaozin A在分子结构确定，细胞毒性的构效关系，细胞生长抑制及凋亡诱导方面进行了系统的研究[9,16-19]，发现wangzaozin A在较高浓度下(3.0～4.0 μmol/L)可损伤HL-60细胞DNA，使细胞大量细滞于S期，诱导细胞凋亡[9].本文首次报道wangzaozin A在低浓度下(0.4～0.8 μmol/L)影响HL-60细胞NADPH氧化酶，上调细胞活性氧水平，进一步诱导HL-60细胞向成熟粒细胞分化，证明了wangzaozin A具有与已报道的对映-贝壳杉烷二萜具有完全不同的作用靶点.而且不同浓度wangzaozin A可诱导完全不同的细胞应答，产生不同的活性效应，这对于该类化合物的抗白血病机制深入研究以及发展新型分化诱导剂具有重要价值.关于NADPH氧化酶介导天然有机小分子诱导细胞分化的报道还很少，本研究也为天然分化诱导剂的筛选与研究提供新思路.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

RPMI1640培养基购自Gibco公司；小牛血清购自杭州四季青公司；二甲基亚砜(DMSO)购自Merck公司；台盼蓝、碘化丙啶(PI)、硝基四氮唑蓝(nitrotetrazolium blue chloride，NBT)、佛波酯 (phorbol esters，TPA)、夹竹桃麻素(apocynin，APO)、吉姆萨均为Sigma公司产品；RNase A购自北京 Solarbio公司；活性氧检测荧光探针DCFH-DA (2′，7′-dichlorfluoresceindiacetate)、抗氧化剂NAC (N-acetylcysteine)购自江苏碧云天生物技术研究所；FITC标记的小鼠抗人CD11b单抗，购自德国Biosciences公司；吞噬荧光探针P(HPMA-FMA)由本实验室合成[20]；其他化学药品为国产分析纯.

对映-贝壳杉烷型二萜化合物wangzaozin A由本实验室从甘肃产总序香茶菜(Isodonracemosa(Hemsl) Hara)中分离得到，并采用现代波谱学方法(紫外、红外、质谱、核磁共振和X-单晶衍射)对其结构进行了确定，为纯度99.5%以上的单体化合物[16]，使用前用DMSO配制成20 mmol/L母液储存于4℃冰箱.其化学结构如图1所示.

图1 Wangzaozin A化学结构式Fig.1 The chemical structure of wangzaozin A

CO2培养箱(美国 Forma Scientific)、超净工作台(苏净集团，江苏)、倒置显微镜(Leitz-diavert)、正置荧光显微镜(Leica DMI4000B，德国)、流式细胞仪(Beckman Coulter Cell Lab Quanta SC Flow Cytometer，美国)、高速低温离心机(BeckmanCoulter Allegra64R，美国).

1.2 细胞培养

人早幼粒白血病细胞株HL-60引自兰州大学生命科学学院.细胞培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中(含100 U/mL青霉素与100 μg/mL链霉素)，置于37℃，5% CO2饱和湿度恒温箱中培养.

1.3 台盼蓝排染法检测细胞生长与存活

取对数生长期的HL-60细胞悬液，以浓度为2×104个/mL接种于24孔培养板中，每孔300 μL，于37℃预培养24 h，分别加入受试药物wangzaozin A(0、0.2、0.4、0.6和0.8 μmol/L)及ATRA(2 μmol/L).每隔24 h收集细胞，取0.4%台盼蓝溶液以1∶4与细胞悬液充分混匀，染色3～5 min 后吸取适量混合液，用血球计数板在光镜下活细胞计数，取平均值，以时间为横坐标，活细胞数为纵坐标绘图.所有实验组均设3个重复.

1.4 流式细胞术检测细胞周期分布

将浓度为2×104个/mL的HL-60细胞悬液以每孔3 mL接种于6孔板，预培养24 h后分别加入不同浓度的wangzaozin A(0～0.8 μmol/L)或ATRA(2 μmol/L)，继续培养48 h和72 h后，1000 r/min离心5 min，弃上清液，预冷的PBS洗2次，加入70%乙醇，在-20℃下固定过夜.1 000 r/min离心5 min，弃去乙醇后用PBS洗2次，加入RNase A，终浓度为100 μg/mL，37℃孵育30 min后，再加入PI(碘化丙啶)，终浓度为40 μg/mL，避光孵育30 min后，260目的尼龙网过滤，上机检测.

1.5 吉姆萨染色观察细胞核形态变化

细胞接种浓度及药物处理如1.4.离心收集药物处理72 h后的细胞，PBS洗2次后用甲醇-冰乙酸(3∶1)固定30 min，铺片，晾干后用PBS配制的Gimesa工作液染色20 min，用蒸馏水冲洗干净，于显微镜下观察拍照.

1.6 细胞NBT还原能力测定

细胞接种浓度及药物处理如1.4.离心收集药物处理72 h后的细胞，PBS洗2次.将待测细胞以106/mL密度重悬于PBS (含2 mg/mL NBT和200 ng/mL TPA)中，37 ℃孵育30 min，离心去上清，涂片，光镜下观察胞浆内含灰蓝色颗粒为阳性细胞.计数300个细胞，计算NBT阳性细胞率.

细胞接种浓度及药物处理如1.4.待药物处理72 h后加入荧光探针P(HPMA-FMA)[20]，使其每孔终浓度为30 μg/mL，继续孵育3 h，离心收集细胞，PBS洗2次，加入1 mL的PBS混匀，吸取500 μL细胞悬液涂片，于荧光显微镜下观察拍照，其余500 μL用于流式细胞仪检测.

1.8 流式细胞术检测HL-60细胞表面抗原CD11b表达

细胞接种浓度及药物处理如1.4.离心收集药物处理72 h后的细胞，PBS洗2次，调整细胞浓度为106/mL，取500 μL细胞悬液加入5 μL的 FITC-CD11b，避光静置孵育30 min，PBS洗1次，于流式细胞仪检测细胞CD11b表达.

1.9 DCFH-DA单染色法检测HL-60 细胞ROS水平

细胞接种浓度及药物处理如1.4.药物处理12 h、24 h后，离心收集细胞，PBS 洗2次.每个样品加入DCFH-DA (10 μmol/L) 荧光探针，37℃孵育30 min，每隔5 min摇匀一次，PBS洗2次，去除未进入细胞内的 DCFH-DA，上流式细胞仪检测.

1.10 NAC联合wangzaozin A影响HL-60 细胞CD11b表达的测定

将浓度为2×104个/mL的HL-60 细胞悬液以每孔3 mL接种于6孔板，培养24 h后，分别加入终浓度为0.6 μmol/L wangzaozin A或0.5 mmol/L NAC或0.6 μmol/L wangzaozin A+0.5 mmol/L NAC，继续培养72 h，收集细胞，PBS洗2次后调整细胞浓度为106/mL，每500 μL细胞悬液加FITC-CD11b抗体 5 μL，避光孵育30 min，PBS洗1次，于流式细胞仪检测CD11b表达.

1.11 APO联合wangzaozin A影响HL-60 细胞CD11b表达的测定

a) 在PLC梯形图程序设计软件里，需做如下设置：打开系统块设置窗口→通信端口设置→PLC地址：2→最高地址：31→波特率：19.2 kbps。将程序重新下载至PLC中。

将HL-60细胞以2×104/mL接种至6孔板，每孔3 mL细胞悬液，培养24 h后，分别加入终浓度为0.6 μmol/L wangzaozin A或0.4 mmol/L APO或0.4 mmol/L APO+0.6 μmol/L wangzaozin A，继续培养72 h，收集细胞，1000 r/min离心5min，弃上清，加PBS洗2次后调整细胞浓度为106/mL，每毫升细胞悬液加入FITC-CD11b 抗体5 μL，避光孵育30 min，PBS洗1次，流式细胞仪检测CD11b表达.

1.12 数据统计

采用SPSS11.0统计学软件进行数据分析:实验所得数据采用x±SD表示(n=3)，实验组与对照组用t检验，实验组的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著.

2 实验结果

2.1 Wangzaozin A对HL-60细胞生长的抑制作用

不同浓度的wangzaozin A 处理HL-60细胞24 h、48 h、72 h和96 h后，用台盼蓝排染法检测活细胞数，结果如图2所示.与对照相比，wangzaozin A(0.2～0.8 μmol/L)在96 h内对HL-60细胞显示了生长抑制作用，并具有剂量和时间依赖效应.对照组细胞在培养96 h之后由于细胞数量过多，受培养基营养限制出现部分死亡，而所有处理组细胞的存活率均大于97%.2 μmol/L ATRA处理组在48 h内与0.4 μmol/L wangzaozin A的抑制活性相当，培养72 h后其抑制活性处于0.4～0.6 μmol/L wangzaozin A之间.

图2 Wangzaozin A对HL-60细胞生长抑制作用Fig.2 The growth inhibition of wangzaozin A on HL-60 cells

流式细胞术进一步检测发现，0.2～0.8 μmol/L的wangzaozin A处理HL-60细胞48 h和72 h后G1期细胞增多，0.6～0.8 μmol/L处理组呈现明显的G1期阻滞；72 h处理组G1期阻滞率高于48 h处理组，同时显示了相应的剂量和时间依赖效应(见图3).

图3 Wangzaozin A引起HL-60细胞周期阻滞Fig.3 The cycle arrest of HL-60 cells caused by wangzaozin A

2.2 Wangzaozin A诱导HL-60 细胞分化

2.2.1 细胞形态变化提示细胞向成熟粒细胞分化

0.2～0 .8 μmol/L wangzaozin A处理HL-60细胞72 h后经吉姆萨染色显示，对照组细胞的核大，多为近圆形，核质比高，核仁清晰；经wangzaozin A处理后，细胞核形不规则，呈现出肾形核(图4红色箭头)、杆状核(图4绿色箭头)和分叶核(图4蓝色箭头)细胞，并且细胞核质比减小，胞质中颗粒状物质增加，与ATRA处理组细胞的变化相似.随着wangzaozin A浓度的升高，肾形核、杆状核和分叶核细胞数量增加，提示细胞趋向成熟粒细胞分化(见图4).

A：对照.B:0.2 μmol/L wangzaozin A.C:0.4 μmol/L wangzaozin A.D:0.6 μmol/L wangzaozin A．E:0.8 μmol/L wangzaozin A.F:2.0 μmol/L ATRA (×400)．

2.2.2 Wangzaozin A增强细胞NBT还原能力 Wangzaozin A对HL-60细胞的NBT还原能力的影响如图5所示.不同浓度的wangzaozin A均可增加细胞内甲臜的沉淀及细胞着色，并随着药物浓度增加细胞着色加深，阳性细胞率增加.0.4 μmol/L药物处理组与对照组比，具有显著性差异(P<0.05)；0.6 μmol/L wangzaozin A处理组的阳性细胞率与2 μmol/L ATRA处理组相近，提高3倍多;0.8 μmol/L 处理组的阳性细胞率提高约4.5倍，与对照组比这3组均达到极显著差异(P<0.01).

2.2.3 Wangzaozin A增强HL-60细胞吞噬能力

对颗粒性异物的吞噬性是粒细胞及巨噬细胞的特性之一，可作为细胞分化程度的特征标志.P(HPMA-FMA)为本实验室合成的高分子荧光探针[20]，与细胞孵育后可通过荧光强度变化确定培养细胞的吞噬特性.利用荧光显微镜可视化检测HL-60细胞对高分子荧光颗粒物质P(HPMA-FMA)的吞噬活性，发现对照组细胞有较弱的颗粒吞噬能力，而经wangzaozin A处理HL-60细胞72 h后，处理组细胞的荧光强度均有增强，表明细胞对荧光颗粒的吞噬能力增强，其中0.6 μmol/L wangzaozin A处理组与2.0 μmol/L ATRA处理组荧光强度相当(见图6 A).流式细胞术检测数据进一步证明wangzaozin A可显著增加HL-60细胞吞噬能力.与对照组相比，0.2 μmol/L、 0.4 μmol/L、0.6 μmol/L和0.8 μmol/L wangzaozin A处理组细胞的荧光强度分别增加了126±7 %、141±10.5 %、163±8.8%和183±9%，并显示了浓度依赖性.ATRA处理组的增加率为159%，与0.6 μmol/L 处理组接近(见图6 B).

A：显示不同浓度wangzaozin A及ATRA处理HL-60 细胞72 h后细胞着色变化 (×400). a：对照组.b:0.2 μmol/L wangzaozin A.c:0.4 μmol/L wangzaozin A.d:0.6 μmol/L wangzaozin A.e:0.8 μmol/L wangzaozin A.f:2.0 μmol/L ATRA.B：不同浓度wangzaozin A及ATRA处理HL-60 细胞72 h后NBT阳性细胞率．

A： 0.6 μmol/L wangzaozin A和2.0 μmol/L ATRA处理HL-60细胞72 h后细胞吞噬P(HPMA-FMA)的荧光显微镜图像(×400).B： 药物处理HL-60细胞72 h后，细胞吞噬纳米荧光颗粒P(HPMA-FMA)的能力．

2.2.4 Wangzaozin A上调HL-60细胞表面抗原CD11b的表达 在血细胞的分化过程中CDllb被认为在原始粒细胞上基本不表达，随着细胞的成熟分化，CDllb表达逐渐升高，因而可作为细胞分化程度的检测指标.不同浓度的wangzaozin A和ATRA处理HL-60细胞72 h后，利用流式细胞术检测其细胞表面CD11b蛋白表达量.如图7所示， 与对照组相比，0.4～0.8 μmol/L处理组细胞CD11b的表达显著上升，均达到极显著水平.ATRA处理组细胞CD11b表达量略高于0.6 μmol/L处理组.

图7 Wangzaozin A及ATRA处理HL-60细胞72 h后对细胞CD11b表达的影响Fig.7 The effects of wangzaozin A and ATRA on the expression of CD11b of HL-60 cells

2.3 活性氧介导wangzaozin A对HL-60细胞的分化诱导

2.3.1 Wangzaozin A上调HL-60细胞ROS浓度 为了探讨ROS是否参与化合物诱导HL-60细胞的分化，利用ROS荧光探针DCF及流式细胞术对细胞内的ROS进行检测.不同浓度的wangzaozin A及2.0 μmol/L的ATRA处理HL-60细胞12 h和24 h后，细胞内ROS含量的变化结果如图8所示.0.6 μmol/L及0.8 μmol/L的wangzaozin A处理细胞12 h后能引起细胞内ROS的升高，并具有显著性差异，但24 h处理组ROS浓度变化不明显；ATRA处理组与0.6 μmol/L wangzaozin A处理组的结果相似，升高细胞内ROS浓度，与对照相比具有显著性差异.

图8 Wangzaozin A和ATRA处理HL-60 细胞12h或24 h后细胞内ROS 含量的变化Fig.8 The change of ROS in HL-60 cells after treatments with wangzaozin A and ATRA for12h or 24 h

2.3.2 NAC抑制wangzaozin A对HL-60细胞的分化诱导作用 为了检测wangzaozin A诱导HL-60细胞的分化是否是与活性氧信号相关联，我们将抗氧化剂NAC(0.5 mmol/L)与wangzaozin A(0.6 μmol/L)联合处理细胞72 h后，用流式细胞术检测细胞表面CD11b表达情况，判断联合作用下NAC对wangzaozin A诱导HL-60细胞分化的影响.如图9所示，0.6 μmol/L wangzaozin A处理HL-60细胞72 h后可显著升高细胞CD11b表达，与对照组相比，达到极显著差异(P<0.01).0.5 mmol/L的NAC单独处理HL-60细胞72 h后对细胞CD11b表达水平无影响；当0.6 μmol/L wangzaozin A与NAC联合处理HL-60细胞72 h后，与0.6 μmol/L wangzaozin A组相比，细胞CD11b表达显著下降，与对照组相比无显著差异，表明抗氧化剂NAC降低或消除细胞活性氧后对wangzaozin A诱导的HL-60细胞分化具有明显的抑制效应，说明活性氧介导了wangzaozin A诱导的分化作用.

2.3.3 APO抑制wangzaozin A对HL-60细胞的分化诱导作用 APO可抑制细胞质膜NADPH氧化酶活性，减弱或消除由NADPH氧化酶所产生的活性氧.APO与wangzaozin A的联合使用可判断诱导HL-60细胞分化的活性氧信号来源是否与NADPH氧化酶相关联.从图10可以看出，APO联合wangzaozin A处理组与wangzaozin A单独处理组相比，HL-60细胞的CD11b表达显著下降，仅为单独处理组的63.2%.表明APO对NADPH氧化酶活性的抑制介导了wangzaozin A对HL-60细胞分化的诱导.

图9 NAC对wangzaozin A诱导HL-60细胞表达CD11b的影响Fig.9 The effect of NAC on the expression of CD11b in HL-60 caused by wangzaozin A

图10 APO对wangzaozin A诱导HL-60 细胞表达的影响Fig.10 The effect of APO on the expression of CD11b in HL-60 caused by wangzaozin A

3 讨论

香茶菜属植物冬凌草作为抗炎及抗癌的药物已临床使用多年，其有效成分冬凌草甲素(oridonin)具有靶向作用于癌蛋白AML1-ETO进一步诱导白血病细胞凋亡的作用[15]，该化合物已有白血病临床试验讯息.最近，另一种对映-贝壳杉烷二萜腺花素(adenanthin)诱导白血病细胞分化及其靶向作用PxⅠ/Ⅱ的机制为该类化合物抗白血病研究提供了新途径[11].

细胞增殖受阻及细胞周期的停滞是细胞分化的重要特征[21].研究显示， wangzaozin A 在0.2～0.8 μmol/L时显著抑制HL-60细胞增殖，延缓细胞周期进程，引起G1周期阻滞，但对其存活无影响，这与该化合物在完全生长抑制浓度下(3.0～4.0 μmol/L)处理36 h后引起S期阻滞及大量细胞凋亡完全不同[9]，显示了该化合物在不同剂量及处理时间诱导了不同的细胞应答信号途径.综合分析wangzaozin A处理HL-60细胞后其细胞形态、NBT还原能力、细胞吞噬能力及细胞表面黏着因子CD11b表达的变化，图片及测试数据均显示wangzaozin A诱导HL-60细胞向成熟粒细胞分化.经0.4～0.8 μmol/L wangzaozin A处理HL-60细胞72 h后肾形核细胞明显增多，随着处理时间延长其杆状核和分叶核细胞逐渐增多，且吞噬性增强，这些特征是粒细胞成熟最显著的细胞学标志[22-23]，其分子标记CD11b在处理组细胞表达升高的证据进一步支持了wangzaozin A可诱导HL-60细胞向成熟粒细胞分化的判断[24].Wangzaozin A诱导HL-60细胞分化的模式与全反式维甲酸及DMSO诱导分化模式相类似[25-26].

研究证实，ROS作为胞内信号分子参与细胞增殖、分化及凋亡等多种信号途径的调控[27]，并且ROS在干细胞或祖细胞的分化过程中是一个关键的调节因子[28].细胞内ROS有多种来源，包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase)、线粒体呼吸链、黄嘌呤氧化酶以及环氧合酶等，而在受体介导的信号传导过程中起作用的ROS主要源于NADPH氧化酶，通过其活性精确调节控制细胞内ROS水平[29-30].目前已证实，NADPH氧化酶源性的ROS可通过p38 MAPK途径激活心肌基因相关转录因子，调控胚胎干细胞向心肌细胞分化[31-32]，为心肌干细胞移植治疗心肌梗塞提供了新的研究靶点.Chen[33]证实黄酮化合物异甘草素(Isoliquiritigenin)在翻译和转录水平上调NADPH氧化酶的gp91phox 和p47 phox亚基表达，提高ROS水平，诱导HL-60细胞向单核细胞分化.外源H2O2也可影响NADPH氧化酶，升高ROS浓度，诱导HL-60细胞分化[34].本文中wangzaozin A处理HL-60细胞12 h后细胞内活性氧浓度显著升高，在该处理组中加入活性氧清除剂NAC后HL-60细胞CD11b表达下调，明显减弱wangzaozin A对HL-60细胞CD11b表达的上调诱导，表明ROS介导了wangzaozin A对HL-60细胞的分化作用；NADPH氧化酶抑制剂APO也可减弱wangzaozin A诱导的分化作用，进一步揭示wangzaozin A诱导的HL-60细胞分化是通过NADPH氧化酶对活性氧生成的调控，即wangzaozin A可能通过激活HL-60细胞NADPH氧化酶，上调ROS浓度，调控相关信号通路，诱导HL-60细胞分化.

本研究提示NADPH氧化酶是干预HL-60细胞分化的重要因子，而Liu[11]报道另一种对映-贝壳杉烷二萜腺花素(adenanthin)可靶向作用另一种早幼粒白血病细胞NB4的过氧化还原酶Ⅰ/Ⅱ，抑制其对ROS的清除作用，诱导NB4细胞分化，显示了相似分子构型的对映-贝壳杉烷二萜可通过两种不同途径影响细胞内ROS水平.另外，没有证据显示adenanthin诱导的分化作用与NADPH氧化酶无关，或者wangzaozin A不能影响过氧化还原酶系统，但两个实验体系的证据均将其分化信号指向了活性氧水平的升高.从理论上讲，进入细胞的化合物可与细胞内多种蛋白质相互作用，其亲和性及作用部位不同，对不同蛋白质功能产生不同影响.重要的是，细胞针对不同信号刺激，整合信号通路进行应答反应.尽管我们的结论尚需在分子水平进一步证实wangzaozin A影响NADPH氧化酶功能的机制，但已有的证据提示wangzaozin A具有抗白血病的潜在价值.

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Wangzaozin A regulates NADPH oxidase-derived reactive oxygen species to induce the differentiation of HL-60 cells

DING Lan， CHEN Yiping， LIU Guoan， WU Yanpeng

(College of Life Sciences， Northwest Normal University， Lanzhou 730070)

The effects of wangzaozin A， a kind ofent-kaurane diterpenoids， on the growth， cellular morphology， NBT-reducing ability， cellular uptake and cell surface markers CD11b of HL-60 cells were determined by trypan blue exclusion method， giemsa stainning and flow cytometry. The results showed that 0.2～0.8 μmol/L wangzaozin A could inhibit the growth of HL-60 cells， cells treated with 0.6 and 0.8 μmol/L wangzaozin A presented obviously G1 arrest. With the increase of the concentration of wangzaozin A and the treatment time， metamyelocytes， banded neutrophils and segmented neutrophils increased， nuclear/cytoplasm ratio decreased， granular substance in cells increased; at the same， NBT-reducing ability， cellular uptake and the expression of CD11b of HL-60 cells enhanced remarkedly， with a obvious dose-and time-dependent manner. The results showed that differentiation of human HL-60 cells into granulocyte could be induced by wangzaozin A. Further， the detection by fluorescence probe DCF showed that ROS in cells treated with 0.6 and 0.8 μM wangzaozin A after 12 h increased obviously; the expression of CD11b induced by wangzaozin A could be markedly inhibited by antioxidant NAC and APO which is the inhibitor of NADPH oxidas. It indicated that wangzaozin A could induce the differentiation of HL-60 cells by up-regulating concentration of NADPH oxidase-derived reactive oxygen species．

wangzaozin A; HL-60 cells; differentiation; ROS; NADPH oxidase

2014-12-01.

国家自然科学基金项目(30960464).

1000-1190(2015)02-0252-09

Q28

A

*E-mail: dinglan@nwnu.edu.cn.