刺玫果提取物胶囊定性定量研究

钟方丽， 杨 扬，2， 王晓林*， 薛健飞， 张林林

(1.吉林化工学院 化学与制药工程学院， 吉林 吉林 132022; 2.吉林大学 化学学院， 长春 130012)



刺玫果提取物胶囊定性定量研究

钟方丽1， 杨 扬1，2， 王晓林1*， 薛健飞1， 张林林1

(1.吉林化工学院 化学与制药工程学院， 吉林 吉林 132022; 2.吉林大学 化学学院， 长春 130012)

建立刺玫果提取物胶囊的定性鉴别和含量测定方法.采用薄层色谱法对刺玫果提取物胶囊进行了定性分析；采用紫外-可见分光光度法，建立了刺玫果提取物胶囊总黄酮的含量测定方法；采用高效液相色谱法，建立了刺玫果提取物胶囊中金丝桃苷的含量测定方法.结果表明建立的薄层色谱鉴别方法，荧光斑点清晰，阴性无干扰；芦丁在4.0～48.0 μg/mL (r=0.9996)，金丝桃苷在0.192～1.152 μg (r=0.9999)线性关系良好；芦丁平均回收率100.05%，RSD为1.40% (n=6)；金丝桃苷平均回收率99.39%，RSD为0.66%(n=6).建立的薄层鉴别方法专属性高，含量测定方法具有良好的精密度，结果准确可靠，可用于刺玫果提取物胶囊的质量控制.

刺玫果提取物； 胶囊； 含量； 金丝桃苷； 总黄酮

刺玫果提取物胶囊是由刺玫果经提取、纯化加工而成，具有理气活血的作用，可用于治疗冠心病、高脂血症等.刺玫果药材中所含的总黄酮类物质具有防治高血脂和血栓所致的心脑血管疾病的功效[1-2]，为了控制该胶囊的质量，本试验建立了胶囊中槲皮素的薄层鉴别，并采用UV、HPLC法分别建立了总黄酮和金丝桃苷的含量测定方法，从而为保证刺玫果提取物胶囊的活性效果提供了依据.本文以芦丁为对照品，采用UV法对刺玫果提取物胶囊中总黄酮的含量、采用HPLC法对刺玫果提取物胶囊中金丝桃苷的含量进行了测定，并采用TLC法对刺玫果提取物胶囊中的槲皮素进行了鉴别.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺玫果提取物胶囊(批号20140201、20140301、20140401、20140402、20140403)及阴性对照样品为吉林化工学院化学与制药工程学院药学系自制.乙腈、四氢呋喃均为色谱纯(天津市北方天医化学试剂厂)；甲醇、冰乙酸为色谱纯(天津市大茂化学试剂厂)；水为重蒸馏水；其他化学试剂均为分析纯；芦丁对照品(批号：100080-200707)，金丝桃苷对照品(批号：111521-201004)，均为含量测定用，购于中国食品药品检定研究院.

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；LC2030高效液相色谱仪(上海天美科学仪器有限公司)；AEG-220电子天平(日本岛津)；KQ-250B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ZF-20D暗箱式紫外分析仪(上海宝山顾村电光仪器厂).

2 结果与分析

2.1 薄层色谱鉴别

取重量差异项下的刺玫果提取物胶囊内容物，研细，取约0.1 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加60%乙醇适量，超声使溶解，放冷并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，作为供试品溶液.另精密称取干燥至恒重的槲皮素对照品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，作为对照品溶液.另取淀粉等辅料制成的阴性胶囊2粒，按上述供试品溶液制备方法同法制成阴性对照溶液.照《中国药典》2010 年版一部附录Ⅵ B薄层色谱法试验[3-5]，吸取上述3批供试品溶液、槲皮素对照品溶液及阴性对照溶液各5 μL，分别点于同一层析硅胶(G)薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸(8∶1)为展开剂，展开，取出，再晾干，以5%AlCl3乙醇溶液均匀喷洒，晾干，置于紫外分析仪(365 nm)下检视，结果如图1所示.在与对照品色谱相应的位置上，显有相同颜色的荧光斑点，阴性对照则无相应的斑点.

1、2、3-供试品；4-金丝桃苷；5-槲皮素；6-阴性对照

2.2 总黄酮含量测定

本品由刺玫果一味中药经提取纯化而制成，具理气活血之功效.刺玫果主要成份为黄酮类、多种三萜酸及没食子酸甲酯等.黄酮类是主要活性成份，为此本文采用紫外-可见分光光度法测定样品中总黄酮的含量[6].

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的芦丁对照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容，摇匀，配制成0.2 mg/mL的对照品溶液，备用.

2.2.2 供试品溶液的制备 取重量差异项下的本品约0.2 g，研细，精密称定，置50 mL量瓶中，加60%乙醇适量,超声使其溶解，冷却并稀释至刻度，摇匀过滤，弃去初滤液，备用.

2.2.3 供试品溶液的制备方法的确定

1)提取溶剂的选择 取重量差异项下的本品约0.2 g，研细，精密称定，分别以30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇50 mL为溶媒，对样品进行超声提取10 min，分光光度法测定结果显示：60%乙醇提取溶液吸光度值最大，所以选择提取溶媒为60%乙醇.

2)提取时间的选择 取重量差异项下的本品约0.2 g，研细，精密称定，以50 mL 60%乙醇为溶媒，对样品进行超声提取5、10、15、20、25、30 min，分光光度法测定结果显示：提取时间为15 min时吸光度值最大，所以将超声时间确定为15 min.

3)提取溶剂用量的选择 取重量差异项下的本品约0.2 g，研细，精密称定，以 60%乙醇20、30、40、50 mL为溶媒，对样品进行超声提取15 min，分光光度法测定结果显示：提取剂用量为50 mL，吸光度值最大，提取溶剂量确定为50 mL.

2.2.4 标准曲线的绘制 精密吸取芦丁对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加4%NaOH溶液10.0 mL，再加60%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min.以未显色的对照品溶液为空白，按照分光光度法，在505 nm处测定其吸光度，以吸收度为纵坐标，芦丁对照品浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线[7-8]，进行直线回归，回归方程：Y=11.67X+0.0175，r=0.9996.结果表明:芦丁在4.0～48.0 μg/mL呈良好线性关系.

2.2.5 精密度试验 吸取对照品溶液2.0 mL于25 mL容量瓶中，按2.2.4节的方法显色，连续测定6次吸光度，RSD为0.50%，结果表明精密度较好.

2.2.6 稳定性试验 取同一批号的刺玫果提取物胶囊内容物0.2 g，精密称定，按供试品溶液的配制方法制成溶液.在同一份供试品溶液中分别于配制后0、1、2、4、6、8、24 h进行显色，以供试品溶液为空白，在505 nm处测定吸光度值.经计算可得RSD值为2.60%，结果表明供试品溶液显色前24 h内稳定性良好.取上述的供试品溶液分别在显色后0、5、10、15、20、25、30、35、40、60 min，在505 nm波长处测定吸光度值.经计算可得RSD值为2.20%，结果表明供试品溶液显色后60 min内稳定性良好，满足测定要求.

2.2.7 重复性试验 取同一批号刺玫果提取物胶囊内容物6份，各0.2 g，精密称定，按2.2.2节的方法制成供试品溶液，吸取0.5 mL于25 mL容量瓶中，按2.2.4节方法显色，在505 nm处测定吸光度值，RSD为0.28%，结果表明重复性良好.2.2.8加样回收率试验 称取6份总黄酮含量已知的刺玫果提取物胶囊内容物，精密称定，每份精密加入芦丁对照品适量，按2.2.2节方法制备供试品溶液，按2.2.4项中方法显色测定，结果见表1.结果表明回收率良好，方法准确性较高，具有可行性.

表1 芦丁加样回收率试验

2.2.9 样品含量测定 按上述胶囊总黄酮含量测定方法测定样品含量，5批刺玫果提取物胶囊中每粒含总黄酮的结果分别为100.51、107.20、115.63、105.65、112.24 mg.

2.3 金丝桃苷含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的金丝桃苷对照品2.40 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.096 mg/mL金丝桃苷对照品溶液[9].

2.3.2 供试品溶液的制备 取重量差异项下的本品，研细，取约0.1 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加60%乙醇适量，超声10 min使溶解，放冷并稀释至刻度，摇匀，过滤，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液.

2.3.3 供试品溶液的制备方法的确定

1)提取溶剂的选择 取重量差异项下的本品约0.1 g，研细，精密称定，置25 mL量瓶中，分别以30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇50 mL为溶媒，对样品进行超声提取10 min，微孔滤膜(0.45 μm)过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样20 μL，金丝桃苷峰面积分别为996 67、164 449、123 056，结果显示：60%乙醇作提取溶剂，相同条件下，峰面积更大，即含提取物质含量最高.

2)提取时间的选择 取本品胶囊内容物约0.1 g，研细，精密称定，置25 mL量瓶中，以 60%乙醇25 mL为溶媒，对样品进行超声提取5、10、15、20、25 min，微孔滤膜(0.45 μm) 过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样20 μL，金丝桃苷峰面积分别为99 167、488 575、207 068、175 226、88 524，实验结果表明超声提取10 min，金丝桃苷含量更大.

3)提取溶剂用量的选择 取重量差异项下的本品约0.1 g，研细，精密称定，置25 mL量瓶中，以60%乙醇10、15、20、25、30 mL为溶媒，对样品进行超声提取10 min，微孔滤膜(0.45 μm) 过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样20 μL，金丝桃苷峰面积分别为653 157、295 247、264 404、305 020、305 125，实验结果表明提取溶剂用量在25 mL时即可将金丝桃苷提取完全.

2.3.4 阴性对照溶液的制备 取淀粉等辅料制成的阴性对照胶囊，按2.2.2节下方法制备阴性对照溶液.

2.3.5 色谱条件及适应性试验 色谱柱：伊利特C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-甲醇-四氢呋喃-0.5%醋酸溶液(1∶1∶19∶79)；流速：1.0 mL/min；检测波长：360 nm[10]；柱温：30℃；进样量：20 μL.在此色谱条件下，金丝桃苷的保留时间为16.08 min，金丝桃苷与其他成分分离度大于1.5，理论塔板峰按金丝桃苷峰计算为3323，阴性对照在相应的保留时间无吸收峰出现.HPLC图见图2.

2.3.6 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，加入60%乙醇定容至刻度，摇匀，制得系列对照品溶液.分别吸取20 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，以对照品溶液进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线[11-13]，回归方程为：Y=3×106X-5.75×105，R=0.9999，结果表明金丝桃苷进样量在0.192～1.152 μg范围内呈良好的线性关系.

2.3.7 重复性试验 取同一批号的刺玫果总黄酮胶囊内容物5份，每份各0.1 g，按上述方法制备5份供试品溶液，各进样20 μL，进行测定，金丝桃苷的峰面积RSD为1.17%，表明方法有良好的重复性.

2.3.8 仪器精密度试验 按上述色谱条件，精密吸取浓度为0.384 μg/mL的金丝桃苷对照品溶液，连续进样6次，每次进样20 μL，记录金丝桃苷的峰面积，结果金丝桃苷的峰面积RSD为0.69%，结果表明精密度良好.

2.3.9 稳定性试验 取供试品溶液，室温下放置，分别于1、2、3、4、5 h进样20 μL，记录色谱图，结果金丝桃苷的峰面积RSD为0.95%，表明供试品溶液在5 h内稳定.

2.3.10 加样回收率试验 精密称取6份已知含量(1.35 mg/g)的样品0.1 g，每份精密加入浓度为0.096 mg/mL金丝桃苷对照品溶液1.40 mL，按照上述方法制备供试品溶液，定容到10 mL容量瓶中，微孔滤膜过滤，按上述色谱条件各进样20 μL，记录峰面积，计算回收率，金丝桃苷的平均回收率为99.39%，RSD为0.66%.结果见表2.

A.对照品溶液； B.供试品溶液； C.阴性溶液

表2 金丝桃苷加样回收率试验

2.3.11 样品含量测定 按上述胶囊金丝桃苷含量测定方法测定样品含量，5批样品中每粒含金丝桃苷测定结果分别为280.75、278.84、276.59、280.28、275.62 μg.

3 结论与讨论

3.1 薄层色谱条件的选择

3.1.1 展开剂的选择 分别以醋酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)、苯-醋酸乙酯-甲酸(6∶4∶1)、氯仿-甲醇-水(28∶10∶1)、醋酸乙酯-甲酸(8∶1)为展开剂对展开系统进行比较，结果显示：醋酸乙酯-甲酸(8∶1)系统槲皮素Rf值适中，斑点分离效果好.

3.1.2 硅胶板的选择 吸取供试品溶液3批、槲皮素对照品溶液及阴性对照溶液，分别考察了自制硅胶G板(玻璃片基)、自制硅胶H板(玻璃片基)、层析硅胶(G)薄板(铝箔片基)、层析硅胶(G)薄板(玻璃片基)的展开效果.结果表明，层析硅胶(G)薄板(铝箔片基)展开效果良好，荧光斑点清晰.

3.1.3 显色剂的选择 本实验分别选用5%AlCl3、9%FeCl3溶液为显色剂，依前述方法显色.结果显示，均匀的喷洒5%AlCl3硅胶板上有明显的荧光斑点；均匀的喷洒9%FeCl3溶液显色剂显色，硅胶板成黑色，荧光斑点不清晰.

3.1.4 供试品浓度及点样量的选择 分别称取刺玫果提取物胶囊内容物0.05、0.10、0.15 g，按供试品溶液的配制方法配制成不同浓度的供试品溶液，用微量注射器分别吸取2、3、5 μL供试品溶液样于硅胶(G)薄层板.结果显示称取0.10 g胶囊内容物配制的供试品溶液，点样量为5 μL时，斑点清晰，Rf值适中，效果较好.

3.2 总结

本试验分别采用HPLC、UV法对刺玫果提取物胶囊中金丝桃苷、总黄酮的含量进行了测定，并建立了刺玫果提取物胶囊中槲皮素的薄层鉴别方法.本试验建立的槲皮素薄层鉴别方法，斑点清晰，Rf值适中；建立的金丝桃苷含量测定方法专属性强、阴性无干扰、线性关系良好，回收率、重现性符合要求；建立的总黄酮含量测定方法线性关系及回收率良好.上述方法可以作为刺玫果提取物胶囊的质量控制方法.

[1] 钟方丽， 陈 帅， 关晓侠. 微波法提取刺玫果总黄酮工艺研究[J].江苏农业科学， 2010(6):449-451．

[2] 王领弟， 李艳荣， 潘海峰， 等. 不同产地刺玫果中总黄酮含量的测定[J].承德医学院学报， 2012， 29(1):5-7．

[3] 魏 屹， 丁雪娇， 包金颖. 高效液相色谱法测定余甘子药材中槲皮素的含量[J].时珍国医国药， 2008， 19(7):1634-1635．

[4] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2010年版一部[M].北京:中国医药科技出版社， 2010:附录34-35．

[5] 钟方丽， 王晓林， 张 俭. 山玫片的薄层鉴别研究[J].吉林化工学院学报， 2007， 24(4):6-8．

[6] 俞作仁， 王文莉， 吕娟涛. 刺玫果化学成分及药理作用研究进展[J].中草药， 2002， 33( 2):188-190.

[7] 王隶书， 王海生， 高 军， 等. 山刺玫不同药用部位中总黄酮的含量测定[J].中国实验方剂学杂志， 2010， 16 (10):56-58．

[8] 任 静， 李多伟， 王童文， 等. 超声萃取苹果渣中总黄酮工艺的研究[J].中成药， 2003， 25(9):761-762．

[9] 傅善权， 郑一敏， 杨艳红， 等. 高效液相色谱法测定青果中金丝桃苷的含量[J].天然产物研究与开发， 2005， 17(增刊1): 67-68．

[10] 孙贺英， 付萍萍， 郝 娜. 反相高效液相色谱法测定照山白中金丝桃苷的含量[J].时珍国医国药， 2007， 18(10):2433-2434．

[11] 胡 伟， 陈飞虎， 吴繁荣， 等. HPLC 法测定鬼针草药材中金丝桃苷的含量[J].安徽医科大学学报， 2008， 43(6): 712-713．

[12] 钟方丽， 王晓林， 敬采月. 高效液相色谱法测定刺玫果中金丝桃苷的含量[J].食品科学， 2010， 24(31):282-284．

[13] 赵艳普. HPLC测定照山白浸膏片中金丝桃苷的含量[J].中成药， 2008， 30(3):456-457．

Study on the quality standard of the fruits extract ofRosadavuricaPall. capsule

ZHONG Fangli1， YANG Yang1，2， WANG Xiaolin1， XUE Jianfei1， ZHANG Linlin1

(1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering， Jilin Institute of Chemical Technology， Jilin，Jilin 132022;
2. School of Chemistry， Jilin University， Changchun 132022)

To establish the qualitative identification and content determination methods of the fruits extract ofRosadavuricaPall. capsule. TLC was used to accomplish the qualitative identification， while UV and HPLC were applied to determine the content of total flavonoids and hyperin of the fruits extract ofRosadavuricaPall. capsule respectively. There was no negative interference in established TLC method， which offered clear fluorescent spots. Rutin and hyperin showed good linear relationship at the range of 4.0～48.0 μg/mL (r=0.9996) and 0.192～1.152 μg (r=0.9999) respectively. The average recovery of rutin and hyperin were 100.05% and 99.39%， while theirRSDwere 1.40%(n=6) and 0.66% (n=6). TLC method obtained was specific and content determination methods were accurate and reliable， which could be applied for quality control of the fruits extract ofRosadavuricaPall. capsule．

fruits extract ofRosadavuricaPall.; capsule; content; hyperin; total flavonoids

2014-11-08.

吉林省科技厅计划项目(20110948).

1000-1190(2015)02-0228-05

R944

A

*通讯联系人. E-mail: wangxiaolin69 @eyou.com.