一种检测近缘物种混合样品的新方法*

贾秀双，王 静，梁兴国

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003)



一种检测近缘物种混合样品的新方法*

贾秀双，王 静，梁兴国**

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003)

结合双重PCR(Duplex PCR，dPCR)和扩增产物熔点的测定，建立了一种定量分析近缘物种混合样品中各物种相对含量的新方法。即针对混合样品中2种物种的DNA序列，各自设计高特异性引物，使2种物种的DNA同时进行PCR扩增而互不干扰，且扩增产物的熔点有足够的差别(> 1℃)；然后进行PCR扩增并测得不同温度下PCR产物同荧光染料结合后的荧光值；该荧光值对温度进行微分所得微分曲线上会产生2个峰(在两物种各自PCR产物熔点温度处)，根据这2个峰的峰高比值同其相对含量的关系，即可完成对各物种含量的定量分析。本研究以长鳍和黄鳍金枪鱼的混合样品为例，对此方法的可行性进行了验证。结果表明，2种成分的含量比与对应峰值比之间线性关系良好；当混合样品中含有10%以上长鳍金枪鱼或5%以上黄鳍金枪鱼时，能够进行较准确的定量检测，证明了本方法切实可行。这一新方法解决了在混合样品中难以准确定量物种的难题，在食品安全和基因诊断领域有广泛的应用前景。

双重特异性PCR；熔点；混合样品；定量分析；物种鉴定

不同物种在商品价值、品质、潜在过敏原种类和受保护程度等方面存在较大的差异，因此亟需建立一种简单、快速、可靠、重复性高的检测方法来保障消费者的权益，规范食品市场和保护濒危物种。然而混合样品，尤其是近缘混合样品的存在，使很多分子检测方法的实际应用受到了很多限制。如FINS中使用的通用引物可能会同时扩增混合样品中的多种成分，造成测序结果混乱[1]；限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)和单链构象多态性(PCR-SSCP)虽然可定性检测不同属、科，甚至不同目的混合物种，但在区分近缘物种的应用方面，其结果更易受种内变异的影响[2-4]，且序列间的高度相似性限制了它们的应用[5]；多重PCR能够对远缘物种混合样品中的组分进行定性分析，但反应体系优化和电泳分析产物耗时长，不适于高通量快速筛选[6]。由于近缘物种模板DNA的序列高度相似，采用多重PCR区分近缘物种时，引物设计困难，很难避免假阳性结果出现[7-8]。采用特异性探针和荧光定量PCR，虽能区分近缘物种及其混合样品，但检测成本较高，且不能对混合样品中的物种进行准确定量分析[9]。可见，目前对于混合样品，尤其是近缘物种混合样品的定量分析，仍面临着巨大的挑战。

利用荧光定量PCR仪测定的PCR产物熔解曲线(特定染料同dsDNA作用发出荧光)，可对病原菌进行定性检测[10-12]，也可用于单核苷酸多态性(SNP)的检测[13]。有报道认为此法与探针法检测的准确度相当[14]，且不易产生假阳性[15]。但对于近缘物种混合样品的定量检测还未见报道。考虑到PCR产物熔点一般只同其GC含量有关，而某一PCR产物的含量同其熔解曲线一次微分后的峰值呈正相关，作者设想，可根据双重PCR的2个产物的相应峰高的比值随物种含量的变化情况来定量分析近缘物种的混合样品。本文以近缘物种长鳍和黄鳍金枪鱼的混合样品为例，建立了双重PCR与熔点分析相结合(Combination of duplex PCR andTmanalysis，dPCR-Tm)的方法，实现对混合样品的定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

标准样品 经过形态学鉴定的长鳍金枪鱼(Albacore,n=11)、黄鳍金枪鱼(Yellowfin tuna,n=20)和大目金枪鱼(Bigeye tuna,n=3)，捕捞于美属萨摩亚岛，由中国海洋大学水产学院高天翔教授提供。

混合样品 购于青岛某超市的长鳍金枪鱼和黄鳍金枪鱼鱼肉(FINS法鉴定)按不同比例混合制备混合样品。

引物由英潍捷基公司合成；SYBR@Select Master Mix(2 ×) 购于Invitrogen公司；苯酚、氯仿和乙醇等购自国药集团；琼脂糖G10(Biowest)；Genegreen DNA染料购于北京天根公司；荧光定量PCR仪(Illumina公司)，伯乐凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 样品DNA提取

标准样品和人工混合样品均采用改良的苯酚氯仿法[16]提取样品DNA。

1.3 引物设计

我们应该遵照我们本性的意愿而生活，即应该追求过一种优美而高尚的生活，要能做到这一点，就是要促使自己的内在灵魂合乎自然地生长起来。但是，人是不能靠自己孤独的生活而促使内在灵魂的生长的，“在本性上而非偶然地脱离城邦的人，他要么是一位超人，要么是一个恶人。……这种人就仿佛棋盘中的孤子。”[2](P6)只有在政治共同体的活动中，人们才具有了过好生活的最终可能性。

选取GenBank上登录的金枪鱼属(Thunnus)、鲣鱼属(Katsuwonus)和舵鲣属(Scombridae)的15个线粒体全基因序列(登录号： GU256526.1，AB101291.1，GU256528.1，NC014059.1，GU256523.1，GU256524.1，NC008455.1，AY302574.2，HQ425780.1，JN086154.1，AB101290.1，AB103467.1，AB105165.1，AB103468.1，NC005318.1)，运用NCBI Blast进行序列同源性比对分析，在进化速率适中的基因中选取种间差异性较大的部分，针对长鳍(A)和黄鳍金枪鱼(Y)设计特异性引物，并运用Primer Premier 6.0软件对引物性能进行评估。

1.4 荧光定量PCR反应和产物熔解曲线测定

荧光定量PCR的反应体系(10μL)为：5μL通用PCR反应预混液(SYBR@Select Master Mix(2 ×) Invitrogen产品)；引物(10 μmol/L)各0.2μL；模板 1μL(约4ng)。 反应条件：50℃UDG处理 2min；95℃ 预变性 2min；98℃ 变性 15s， 一定温度下(55、58或62℃) 退火 30s，72℃ 延伸 30s, 78℃ 10s 读取荧光，30～35个循环。熔解曲线测定条件：98℃ 15s变性后缓慢降温至65℃(降温速率0.2℃/s)，保持30s，然后缓慢升温至95℃(升温速率0.2℃/s)，并在升温过程中测量不同温度下的荧光值。测量后用仪器自带软件进行一次微分，并进行相关分析。

1.5 电泳分析

取5μL扩增产物采用2.0%琼脂糖凝胶(含DNA染料Genegreen)进行电泳1h后，置于伯乐凝胶成像仪(Gel Doc XR+)上成像。

2 结果与分析

本文选取了价格差异显著的长鳍金枪鱼和黄鳍金枪鱼(金枪鱼罐头常用原料，前者价格显著高于后者)作为研究对象，设计相应引物进行混合样本的双重特异性PCR，根据物种特异性扩增片段的Tm值及熔解曲线的差异对样品中各组分进行定量分析。为评价所设计的引物的特异性，分别选取了经过形态学鉴定的11个长鳍金枪鱼(Albacore)个体和20个黄鳍金枪鱼(Yellowfin tuna)个体进行试验，同时还使用了同属的3个大目金枪鱼(Bigeye tuna)个体作为对照。

2.1 引物设计

表1 荧光定量PCR所用引物Table 1 Primers for real-time PCR assays

注：a表示引物序列中加粗字体表示引物和黄鳍金枪鱼之间的错配碱基；下划线标注的字体为引物和大目金枪鱼间的错配碱基；斜体表示引物和长鳍金枪鱼之间的错配。b表示引物与长鳍金枪鱼(GU256526.1, AB101291.1)、黄鳍金枪鱼(GU256528.1)和大目金枪鱼(NC014059.1)的结合位点。

a： Bold letters indicate mismatches between primer and yellowfin DNA; Underlined letters indicate mismatches between primer and Bigeye DNA; Italic letters indicate mismatches between primer and Albacore DNA.b： Locations are in reference to Albacore (GU256526.1, AB101291.1); Yellowfin tuna (GU256528.1); Bigeye tuna (NC014059.1).

2.2 引物特异性评价及扩增产物Tm值确定

选取来自长鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼和大目金枪鱼3种模板，在相同的反应条件下对3组引物A246-F/A246-R(A)、Y303/338-F/Y338-R (Y1)和Y303/338-F/Y303R (Y2)的特异性进行评估。如果条件适当，引物组A只对长鳍金枪鱼扩增阳性，引物组Y1和Y2只对黄鳍金枪鱼扩增阳性。选取55、58和62℃ 3个退火温度分别进行PCR反应(35个循环)。PCR的结果表明55℃退火时，大目金枪鱼在30个循环时已经出现大量的阳性扩增产物(数据未给出)；退火温度为62℃时，扩增应为阳性的少数个体扩增失败(数据未给出)。退火温度为58℃时，3对引物(A、Y1、Y2)都获得了理想的区分结果，从而选取58℃为合适的PCR退火条件。

表2 单重荧光定量PCR的Ct值和Tm值统计结果Table 2 The statistics of Ct and Tm values of three groups of simplex-PCR annealing at 58℃

表2列出了退火温度为58℃时，3组引物的单重荧光定量PCR的Ct值和Tm值(见表2)。结果显示：引物组A检测3种单一模板，循环数大于28.59时，能将11个阳性样本(长鳍金枪鱼)全部检出；循环数小于31.54时，23个阴性样本DNA不会被扩增。同样，引物组Y1和Y2的PCR循环数在28.73～31.32和29.57～33.09时均不会出现阳性个体和阴性个体误检的情况。对于不同的个体，Ct值变化较大，可能是由于模板含量波动造成，这里采用同种鱼不同个体Ct值的平均值作为设定循环数的参考，即将双重PCR的循环数设为30，达到区分几种鱼的目的。

综合以上分析，最终确定双重PCR的反应条件为：50℃ UDG处理2min；95℃ 2min；98℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 30s, 78℃ 10s读取荧光，30个循环。

为达到对混合样品定量检测的目的，一般要求Tm值相差1℃以上，同时Tm值测量误差越小越好。因此，对扩增片段的Tm值及其波动范围的确定是十分必要的。本文对3种金枪鱼的多个个体进行单重PCR并测定了产物的Tm值(见表2)。测定结果显示来自长鳍金枪鱼的246 bp片段(A)Tm值为81.4～81.5℃；黄鳍金枪鱼的338 bp片段(Y1)和303 bp(Y2)的Tm值分别为83.2～83.5℃和82.8～83.1℃。3种片段各自的Tm值的测量误差在0.3℃以内。A(246 bp)和Y1(338 bp)2种片段Tm值相差(1.9±0.1)℃，A (246 bp)和Y2 (303 bp)2种片段Tm值相差(1.5±0.1)℃；理论上，熔解曲线峰(即A-Y1组合或A-Y2组合)均能够分开。因此，使用2组引物(A-Y1或A-Y2)双重PCR体系的扩增产物能够通过熔点测定进行区分。

从Y1和Y2的单重PCR结果(表2中Ct值)看，2对引物的特异性都很好，都不会扩增非目标鱼种(长鳍和大目金枪鱼)。Y1扩增产物与A扩增片段的Tm差异大于Y2扩增产物与A扩增片段之间的差异，由此判断由A-Y1引物组合建立的dPCR-Tm体系应优于用A-Y2建立的dPCR-Tm体系。

2.3 dPCR-Tm检测混合样品

为研究dPCR-Tm是否具有对长鳍和黄鳍金枪鱼的混合物组分进行定量分析的能力，制备了由两种金枪鱼(质量比不同)组成的混合样品。各混合样本中长鳍和黄鳍金枪鱼的质量比依次为： 19/1、7/1、4/1、3/1、2/1、3/2、1/1、2/3、1/2、1/3、1/4、1/5.5、1/9、其中长鳍金枪鱼的含量为： 95%，87.5%， 80%，75%，66.7%，60%，50%， 40%， 33.3%， 25%，20%，15.4%和10%。

首先选取上述扩增产物Tm值相差较大和引物特异性好的A-Y1 (A246-F、A246-R、Y303/338-F、Y338-R) 引物组合建立的双重PCR体系进行混合样本的检测。结果显示(见图1)，当长鳍金枪鱼含量高于25%时，能够检测到2个熔解曲线峰，分别为A峰(81.4～81.5℃，左)和Y1峰(83.2～83.5℃，右)(见图1a)。但不幸的是不论2种金枪鱼比重孰多孰少，Y峰峰值都高于A峰峰值，即A-Y1建立的dPCR-Tm体系并不适合对混合样品进行量化分析。

(a图使用A-Y1引物，b图使用A-Y2引物。纵坐标为荧光值对温度的一次微分值。a: Using A-Y1 combination as primers. b： Using A-Y2 combination as primers. The vertical coordinate is the value of first order differentiation.)

图1 混合样品的PCR产物熔解曲线分析
Fig.1 Anlysis of melting curves of PCR products from mixtures

为找出双重PCR结果异常的原因，作者用A-Y1引物组扩增单一模板(长鳍金枪鱼或黄鳍金枪鱼)发现：当只存在长鳍金枪鱼模板(120或12 pmol/L)时，仍然检测到2条DNA条带，分别为246 和338 bp(见图2)；当只存在黄鳍金枪鱼模板(120或12 pmol/L)时，只检测到一条338 bp的条带。分析原因，发现这是由于该体系中有一条引物(Y338-R)与2种DNA(长鳍和黄鳍)均完全匹配，导致引物Y338-R和A246-F同长鳍金枪鱼模板完全互补而得到了338 bp的产物(见表1)。这表明建立双重PCR方法，设计引物应保证双重PCR体系中的每条引物对非目的模板都有一定的区分能力，各对引物的扩增互不干扰。

(L:100 bp DNA Ladder)图2 2对引物对单一模板的扩增结果

本文进一步对A-Y2(A246-F、A246-R、Y303/338-F、Y303-R)引物组合建立的双重PCR体系进行了评估(图2右侧)。结果显示：A-Y2引物组合扩增单一模板时，分别只有一种扩增产物，即246 bp(长鳍金枪鱼)或303 bp(黄鳍金枪鱼)。这表明引物互不干扰，可以使用A-Y2组合，研究dPCR-Tm方法对混合样品定量检测的可行性。

选用A-Y2组合建立的dPCR-Tm体系检测混合样品的结果如图1b所示(另参见附图1)。当含有5%及以上长鳍金枪鱼时，该体系能够检测到A峰(对应温度81.5℃)即长鳍金枪鱼的存在；当含有10%及以上黄鳍金枪鱼时，该体系也能够检测到Y峰(对应温度82.8～83.1℃)。将Y峰和A峰的峰值比对2种鱼鱼肉的含量比作图发现，峰高比值与混合物中黄鳍金枪鱼(Y)和长鳍金枪鱼(A)含量比呈线性关系(见图3)。当黄鳍金枪鱼含量多于长鳍金枪鱼时，峰值比和含量比的线性拟合相关系数：R2=0.96，线性关系良好(见图3a)。当长鳍金枪鱼含量多于黄鳍金枪鱼时，峰值比和含量比的线性拟合相关系数：R2=0.99，线性关系良好(见图3b)。由此说明A-Y2引物组合建立的dPCR-Tm体系可以定量分析各组分的含量。

为了进一步评估A-Y2引物组合建立的dPCR-Tm体系定量分析2种金枪鱼混合物的准确性，本研究制备了8个混合样品并使用A-Y2体系进行了检测分析。将分析得到的熔解曲线峰值比代入图3a 或图3b所示的关系式中，计算混合物中长鳍金枪鱼或黄鳍金枪鱼的含量。dPCR-Tm测定的金枪鱼含量与实际含量比较结果(见表3)表明：该dPCR-Tm体系定量分析混合样品含量的误差在5% 以下。

综上，长鳍金枪鱼的含量在10%～95%的范围内，都可以进行定量检测，误差一般可控制在5%以下。而一般定量PCR的方法分析混合样品时，需要分别进行扩增和定量分析，误差较大而且难以控制。可以认为，本文所建立的dPCR-Tm方法具有很强的对近缘物种混合物进行量化分析的能力。

(a 图为长鳍金枪鱼含量少于50%，b图为长鳍金枪鱼含量多于50%。a: The content of Albacore was less than 50 percent. b: The content of Albacore was more than 50 percent.)

图3 长鳍和黄鳍金枪鱼含量比随对应熔解曲线峰值比的变化

Fig.3 The ratio of content between Albacore and Yellowfin tuna along with the ratio of corresponding peak value

表3 A-Y2引物组合建立的dPCR-Tm体系检测混合样品中长鳍金枪鱼含量的误差分析结果Table 3 Error analysis results of detection of Albacore content in mixture using A-Y2 dPCR-Tm assays

Note:①Ratio of peak value Y/A=0.99×Content ratio Y/A；②Ratio of peak value A/Y=1.12×Content ratio A/Y；③Ratio of peak value；④Measured content；⑤Actual content；⑥Relative error

3 讨论

本研究将双重PCR和熔解曲线测定法结合，利用引物的高特异性和扩增片段熔点的差异以及各产物量的比值对熔解曲线的影响，建立了能够对近缘物种混合物组分进行定量分析的方法。以长鳍金枪鱼和黄鳍金枪鱼的混合样品的检测为例，此方法能够检测到5%的长鳍金枪鱼和10%的黄鳍金枪鱼，并能进行较准确地定量分析。在一定的缓冲溶液中，较短DNA的Tm值受GC含量、双链长度和DNA 浓度的影响[17]。而对于长链DNA，因其变性过程中往往产生局部熔解，GC含量低的部分先解链，一般认为熔解单元的长度为40～100 bp[18]。长度大于100 bp时DNA的Tm值一般只受GC含量和溶液条件的影响。另外，种内变异带来的几个碱基的变化对Tm值的影响也很小(同一物种的不同个体之间的PCR产物的Tm测定误差在0.3℃以内)。因此本文建立的方法只需判断特异性引物处的种内保守程度，不必考虑片段内序列的变异。这也是本方法优于PCR-RFLF、PCR-SSCP和探针法之处[6-8]。

与分别进行单重定量PCR，通过比较Ct值的定量方法相比，本方法同时扩增2种模板，直接根据熔解曲线一次微分的峰值比得到各种组分的含量，大大减少了操作不当带来的误差。另外，常规定量PCR方法需要分别对标准样品进行绝对定量，对模板质量要求很高。而本方法只要将2种原料样品(不是提取后的DNA)按不同比例混合，然后提取DNA进行PCR，做出标准曲线，即可准确测定未知含量的混合样品。虽然已有研究人员利用多重PCR和熔点测定法对病原菌检测[10-12]，但这些研究只是针对不同科甚至不同目的病原菌(非近缘物种)的混合样品进行的定性检测。

建立此方法需要设计高特异性的引物，要求能够将目标物种与其他物种分开，即阳性扩增和阴性扩增物种的Ct值(单重PCR)差异足够大。如本文设计的3组引物(A、Y1和Y2)扩增不同物种的Ct值相差9左右，区分相似模板的能力很强；但需要注意的是，不能简单通过单重PCR评估引物的特异性，还要考察双重PCR的引物体系对单一模板的扩增情况，必须保证2个扩增互不影响，这是此方法对混合样品准确定量的前提。如：本文中使用的A-Y1组合，虽然A引物组和Y1引物组能很好地区分2种模板，但A引物组和Y1引物组共同存在时，使用长鳍金枪鱼模板能扩增2种片段(见图2)，不适合做双重PCR。只有正反向引物都有足够区分模板能力时才能保证双重PCR顺利进行。A-Y2组合的Y303-R引物在3(末端引进一个针对长鳍金枪鱼模板的A/T错配(同黄鳍金枪鱼模板完全互补)，只能扩增黄鳍金枪鱼模板，实现了双重PCR扩增。

本文针对长鳍金枪鱼和黄鳍金枪鱼混合样品建立的dPCR-Tm体系能够检测出10%的金枪鱼，此检测限低于FDA中对于混合金枪鱼罐头中对长鳍金枪鱼的含量要求(20%)。不同金枪鱼罐头(混合比不同)，价格差异显著。FDA中规定标签为白金枪鱼的产品中只能含有长鳍金枪鱼，而本文建立的方法至少可以检测到5%的黄鳍金枪鱼，可以用于白金枪鱼产品的质量检测。

总之，本文建立的dPCR-Tm方法能够快速、简便、准确地对混合样品中的物种组成进行定量分析，解决了混合样品中各物种难以准确定量的难题。可以推断，本方法在食品安全，含多种耐药基因的菌株筛选，以及基因诊断等领域有广泛的应用前景。

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责任编辑 朱宝象

A Novel Method of Identifying Close-Related Species in Mixed Species

JIA Xiu-Shuang, WANG Jing, LIANG Xing-Guo

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

A novel quantitative analysis method for measuring the content of two close-related species in their mixture were developed based on the combination of duplex PCR (dPCR) and melting temperature (Tm) measurement of PCR products. At first, primers were designed to carry out dPCR to amplify simultaneously one DNA fragment from one species and another fragment from the other species. The two PCR products were designed to have enough difference inTm(>1℃). Then dPCR was carried out, and theTms of PCR products were measured by recoding the fluorescence change with temperature, which is caused by different intensity of fluorescence between dsDNA and ssDNA in the presence of a dsDNA-binding dye. There should be two peaks on the plot of first differential of fluorescence value to temperature atTms of each PCR product, and the quantitative analysis of relative content can be carried out according to the ratio between the heights of two peaks. Here, mixtures of albacore and yellowfin tuna were taken as an example to assess the feasibility and efficiency of this method. The results showed that there is a good linearity between the content ratio and peak height ratio. The method can accurately quantify the content of each species, e.g. more than 10% of albacore or more than 5% of yellowfin tuna, indicating that this approach is practical. This novel method can solve the problem of quantitative analysis of mixed species and have a wide range of applications in food safety, genetic diagnosis and so on.

duplex PCR; melting temperature; mixed species; quantitative analysis; species identification

山东省自然科学杰出青年基金项目(JQ201204)；长江学者和创新团队发展计划项目(IRT1188)资助

2014-03-11;

2014-05-08

贾秀双(1988-)，女，硕士生，研究方向：海洋资源微生物及生物工程。E-mail: xiushuangjia@163.com

** 通讯作者： E-mail: liangxg@ouc.edu.cn

TS201.6

A

1672-5174(2015)04-046-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20140083