结肠癌KRAS蛋白磷酸化与化疗抵抗的相关性研究

王静宇，黄凌鲲

（1.湖南省郴州市第一人民医院临床药学室，郴州 423000；2.湖南省郴州市第一人民医院麻醉科，郴州 423000）

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，但直结肠癌的发病率，存在较大的地域差异。在发达国家中结肠癌的死亡率呈现下降的趋势，但是在发展中国家死亡率还在继续增加［1］。我国结直肠癌的发病率近年来出现上升趋势。结直肠癌发生是遗传和环境因素共同参与的发展过程，但其致病机制并未完全阐明。已经证实多个基因参与了结肠癌的发生，而且多个基因之间相互关联起了协同作用。然而，当癌基因与抑癌基因之间的平衡紊乱后，癌基因的异常激活导致细胞持续增殖，同时抑癌基因功能损伤时，癌细胞将逃避机体免疫机制监控从而形成肿瘤。化疗是治疗结直肠癌的常用手段，全身的化疗会大大提高晚期大肠癌的预后，但由于个体基因表型的差异，患者对化疗药物耐药的情况发生较高。因此对结直肠癌基因表达程度或者变异的检测，将为找到适合结直肠癌化疗敏感药物、提高结直肠癌的预后、减少耐药不良事件的发生提供最优的方案。 这种个体化的基因检测能为结直肠癌治疗提供新的思路。目前，针对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的靶向抗肿瘤药物（如西妥昔单抗和帕尼单抗等）已被广泛用于结肠癌的治疗［2］。KRAS蛋白是EGFR信号通路下游的小分子G蛋白，为EGFR信号通路的重要组成部分之一。在结肠癌中，KRAS基因突变后可以导致EGFR信号通路异常激活，从而不受EGFR上游蛋白的调控［3］。而用于治疗的EGFR单抗（如西妥昔单抗和帕尼单抗等）与可以与细胞膜表面EGFR结合，阻滞EGFR信号通路的传导，但由于该阻滞发生在KRAS上游，因此KRAS基因突变后发生自身磷酸化，使得EGFR结构发生改变，同样可以激活EGFR信号通路，从而抵抗EGFR单抗的作用，使得EGFR干预治疗无效［4］。同时，有研究表明KRAS突变且NF-κB活化患者对化疗高度抵抗以及预后不良。因此，是否KRAS基因突变后发生的自身磷酸化与化疗抵抗存在相关性？本研究在结肠癌化疗病人结肠癌组织中检查了KRAS蛋白的磷酸化状态，探讨KRAS蛋白磷酸化对化疗疗效的影响。

1 资料与方法

1.1 结肠癌的诊断，组织来源 所有组织样本取湖南省郴州市第一人民医院。自2008年9月到2012年9月手术切除52例直肠癌标本。病例的诊断依据患者的临床资料、影像学检测、肠镜检查、和肿瘤标志物，并最后得到术后病理科两位医生的独立确认。肿瘤组织标本收集方法为：切除后20分钟内的肿瘤部位组织。 肠管断端获取正常组织。

1.2 临床资料收集 收集详细的临床资料：包括姓名，性别，年龄，是否有遗传家族病史，手术前是否进行化疗。以及肿瘤的部位，WHO分级，肿瘤大小，分化的程度，组织学类型。肿瘤分期采用TNM分期系统。肿瘤组织选择的标准：病理诊断明确，CT 证实有病灶存在，有临床客观观察指标。治疗前血常规、肝肾功能、心电图基本正常，卡氏评分60 分以上。未出现严重肝、肾功能障碍, 或者其他恶性肿瘤的病史，以及化疗药物过敏者。

1.3 化疗方案 52例患者采用FOLFOX4方案：亚叶酸钙200mg/m2，2h静脉输注；5-FU 400mg/m2静脉推注，然后F-FU 600mg/m2静脉滴注维持22h，d1-2；奥沙利铂85mg/m2静脉输注d1；每2周重复。按UICC 推荐的实体瘤疗效评定标准分为：完全缓解、部分缓解、稳定、进展。完全缓解、部分缓解患者归于不对抗治疗组，稳定、进展患者归于对抗治疗组。

1.4 随访 随访方式主要为电话采访。 随访截止日期为2013年8月31日。该时间段内有44例患者死亡。随访时间为5.1～50.2个月，中位随访时间为31个月。2例患者失访，随访率为96.2%。

1.5 免疫组织化学 在结肠癌肿瘤部位获取肿瘤组织、肠管断端获取正常组织，所有标本都最后经术后病理证实。其中正常组织40例，结肠癌组织52例。应用二甲苯脱蜡、不同浓度的酒精进行脱水。 使用蒸馏水配制新鲜的3%H2O2，室温下灭活内源性过氧化物酶10 min，使用蒸馏水洗3次，每次2 min，微波修复抗原：将玻片浸入0.01M浓度的枸橼酸盐缓冲溶液（PH值为6.0），在微波炉中加热5 min，冷却10分钟，再次中加热3min后自然冷却，0.1M 的PBS洗3次，每次5 min，3%的胎牛血清封闭液，室温下封闭20 min，加入一抗200μL［GTPase Kras (pSer145) antibody，Antibodiesonline，1∶100］，4℃过夜。阴性对照使用对应种属来源的IgG，0.1M的PBS洗3次，每次5 min，加入生物素化二抗200μL，室温孵育20 min，0.1M的PBS洗3次，每次3 min，辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），室温孵育20 min，0.1M的PBS洗3次，每次3 min，加入新鲜配制DAB显色剂，镜下控制染色，充分终止反应，苏木素轻度复染，随后脱水，透明，使用中性树脂封片。结果拍照后，使用Image J定量分析软件进行分析，计算单位面积内信号的平均强度。

1.6 免疫印迹 使用1mL 2×SDS 裂解缓冲液匀浆裂解200mg组织10min，使用超声仪器超声5s×3次。BCA蛋白定量试剂盒对裂解蛋白进行定量，每个样品取40μg总蛋白进行上样。制备12% SDS-PAGE分离胶，5%浓度的堆积胶，堆积胶使用80V恒压电泳，分离胶使用140V恒压电泳。转膜使用290mA，恒流转膜2h，3%的胎牛血清作为封闭液，封闭1h。使用封闭液稀释抗体［GTPase Kras (pSer145) antibody，Antibodies-online，1∶1000；KRAS，磷酸化ERK（pERK），ERK抗体，Cell signaling，1∶1000］。室温孵育2h。0.1% Triton X-100/PBS洗膜2次，每次10min。封闭液稀释的HRP 二抗室温孵育1h。0.1% Triton X-100/PBS洗膜3次每次10min，按ECL ECL液作为底物，孵育膜5min。暗室中显影。

1.7 统计方法 数据使用利用Prism5统计软件进行统计分析和作图。采用独立t检验和配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

所有52例结肠癌患者，手术治疗后，都行FOLFOX4方案治疗。其中，男性 30 例、女性22例；年龄26～78岁，平均年龄61.3岁。不抵抗治疗组39人，抵抗治疗组13人。52例患者的中位生存时间为21.5个月（18.3～24.6个月）。5-FU抵抗组中位生存时间为 8.9个月（6.2～11.4个月），5-FU不抵抗组患者的中位生存时间为28.3个月（18.2～35.6个月），我们在正常对照组，5-FU抵抗组和5-FU不抵抗组样本检测了磷酸化KRAS的表达情况，在使用正常对照组标化为1条件下，5-FU不抵抗组其相对表达量为1.32±0.39（于对照组相比没有统计学差异）；而5-FU抵抗组其相对表达量为3.18±0.51（于对照组和5-FU不抵抗组相比P＜0.01，具有统计学差异，图1）。代表性的磷酸化KRAS染色结果见图2。

我们也同时在正常对照组，5-FU抵抗组和5-FU不抵抗组样本使用免疫印迹技术检测了磷酸化KRAS和总KRAS的表达情况，在使用正常对照组标化为1条件下，5-FU不抵抗组其相对表达量为1.14±0.24（于对照组相比没有统计学差异）；而5-FU抵抗组其相对表达量为3.15±1.04（于对照组和5-FU不抵抗组相比P＜0.01，具有统计学差异，图3B）。

图1 5-FU不抵抗组和对抗组磷酸化KRAS相对值

图2 图1 5-FU不抵抗组和对抗组磷酸化KRAS免疫染色图

为了验证KRAS的磷酸化是否激其下游的信号通路，我们选择了Raf/MEK/ERK通路中的关键蛋白ERK进行了检测，我们也检测了ERK的磷酸化情况，结果显示，在使用正常对照组标化为1条件下，5-FU不抵抗组其相对表达量为0.85±0.34（于对照组相比没有统计学差异）；而5-FU抵抗组其相对表达量为2.12±0.47（于对照组和5-FU不抵抗组相比P＜0.05，具有统计学差异，图3B）。代表性样品免疫印迹结果见图3A

图3 免疫印迹检测FU不抵抗组和对抗组KRAS和ERK表达

3 讨论

EGFR是ErbB受体家族成员，文献报道在60%～80%的结肠癌中EGRF表达增加；其配体（EGF或TGF-α）与EGFR胞外段结合使之二聚化，因此EGFR构象改变，导致胞内段酪氨酸激酶活化，激活一系列信号转导的级联反应，最终促进细胞增殖，血管生成，转移和抑制细胞凋亡。在结肠癌的化疗中，使用EGFR单抗，与EGFR结合，封闭EGFR与配体结合，从而抑制EGFR的活化，从而阻止其介导的信号传导途径，减少肿瘤细胞增殖扩散。有研究表明，这种单抗的使用还可抑制肿瘤细胞对化疗和放疗损害的自我修复能力，同时也能抑制新生血管的生成，这些抑制作用将从整体上对肿瘤生长产生抑制效应。在没有配体的情况下，EGFR酪氨酸激酶自体磷酸化的方式也可以激活Raf/MEK/ ERK通路。一旦该通路发生过度激活，与细胞增殖和细胞周期相关的基因被转录激活，从而导致肿瘤的形成。KRAS蛋白是EGFR信号通路下游的小分子G蛋白，是EGFR信号通路的基本组成部分。作为该通路的下游基因，RAS基因被报道在多种肿瘤中发生突变，可以直接参与Raf/MEK/ERK的激活过程。从而不受EGFR上游信号调控。此时，EGFR单抗与细胞膜表面EGER结合，虽阻滞了EGFR的活化，但由于KRAS在EGFR的下游，KRAS基因突变后可发生自身磷酸化，仍然活化EGRF下游基因［4］，从而使得EGFR单抗治疗无效。因此，临床上在使用EGFR单抗进行治疗之前必须要进行KRAS基因突变的检测［5-7］。由于该种单抗治疗费用昂贵，在我国病人很少接受EGFR单抗联合化疗。在我国虽然越来越多的其他药物已经应用于晚期结直肠癌患者的治疗，但氟尿嘧啶仍然是最常用的治疗结直肠癌药物。而以往有研究表明KRAS突变结肠癌患者对放化疗抵抗以及对EGFR单克隆抗体治疗效果差。在本研究中，我们发现KRAS磷酸化的增加，从而导致其下游的Raf/ MEK/ERK通路活化，能产生结肠癌患者化疗对抗。这提示KRAS突变导致磷酸化增加和下游信号通路的活化可能不仅仅是对抗EGFR单抗，也是对抗5-FU化疗的可能机制，但其具体作用机制有待进一步研究。

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