硬骨鱼IgM结构和功能及其体液免疫应答

叶剑敏， 王玉红， 丁明媚， 尹晓雪

(华南师范大学生命科学学院，广东省水产健康安全养殖重点实验室，广州 510631)

硬骨鱼IgM结构和功能及其体液免疫应答

叶剑敏*， 王玉红， 丁明媚， 尹晓雪

(华南师范大学生命科学学院，广东省水产健康安全养殖重点实验室，广州 510631)

经典免疫学理论有2个基本模式阐述抗体免疫反应的发展和功能：(1)亲和力成熟依赖于机体本身的和通过突变形成的高亲和力抗体的抗原驱动选择过程；(2)抗体的生物效应功能是由抗体的类型所决定的.最近研究发现硬骨鱼的免疫系统通过调控结合抗原的亲和力大小来改变分泌的IgM抗体同质异构体结构的比例，从而影响其抗体在血清中的半衰期.这种独特性质的发现是对经典免疫学理论的补充和扩展.文章概述了硬骨鱼IgM抗体结构和功能的亲和力驱动调节，并介绍维持体液免疫记忆的长寿命浆细胞和记忆性B细胞的性质以及抗体分泌细胞(如原浆细胞、浆细胞)在体液免疫应答中的作用.了解硬骨鱼IgM结构和功能的关系，以及不同分化阶段B细胞维持体液免疫反应的机制，将有利于探索构建硬骨鱼免疫评价体系，并为高效的渔用疫苗开发和疫苗效果精确性评价奠定理论基础.

硬骨鱼； IgM； 同质异构体； 亲和力； 体液免疫应答

IgM是普遍存在于几乎所有脊椎动物中的一种重要的免疫球蛋白[1].在哺乳动物的免疫系统中，大量的研究证实了IgM的重要性[2-4].IgM不仅是适应性体液免疫反应中出现的第一种免疫球蛋白，而且非特异性的IgM还是天然免疫系统中的一道有效屏障[1,5].无论在硬骨鱼系统免疫组织中还是在粘膜组织中，与其它类型的免疫球蛋白(IgD, IgZ/T)[6-8]相比，IgM占据了含量上的绝对优势(高达90%以上)[9-10]，同时在免疫防御中起重要作用[10-11].

当机体受到抗原刺激后，初始B细胞(Mature naïve B cells；未免疫的、成熟幼稚B细胞)激活分化为原浆细胞(Plasmablast cells；寿命短，增殖分化，分泌少量抗体)，在相关细胞因子和分化信号的诱导下，增殖分化为短寿命浆细胞(Short-lived plasma cells；寿命短，不增殖，大量分泌抗体)，随后迁移到适合生存的微环境中成为长寿命浆细胞(Long-lived plasma cells；寿命长，不增殖，大量分泌抗体)[12-13].目前，长寿命浆细胞的发现及其在体液免疫记忆(Humoral memory)中的作用已经引起极大的关注[12,14-16].由于其维持体液免疫记忆的特性，长寿命浆细胞被认为是维持免疫记忆的主要细胞之一[13,15-18].最近报道长寿命浆细胞在硬骨鱼中存在，并维持硬骨鱼的体液免疫记忆，但不同于哺乳动物的是其主要存活于头肾组织中[14].本文介绍最近报道的IgM结构及功能独特性质的发现及不同分化阶段B细胞在维持体液免疫反应中的作用.

1　IgM结构和功能

IgM是存在于机体血清和粘液中一种重要的免疫球蛋白，在硬骨鱼中包括分泌的四聚体形式和B细胞表面的单聚体受体(BCR)形式.虽然19世纪80年代初期曾有报道指出巨石斑[19]、羊头鲷[20]、虹鳟鱼[21]血清中存在IgM的单体，后来推测其很可能是IgT或IgZ单体[22].因此，硬骨鱼中是否存在分泌型IgM单体仍有待证实.迄今为止，IgM亚型的发现仅在鲑科鱼中有报道[23].

不同于哺乳动物完全聚合的五聚体IgM，硬骨鱼IgM是一个四聚体[20,24]，更为独特的是，该四聚体IgM具有同质异构体[14,20,24].IgM重链C末端二硫键的聚合程度的不均一性，导致四聚体IgM仅有部分是完全聚合的，而其余部分的聚合程度并不完全[14,20,24].从1981年Lobb等[20]首次发现斑点叉尾鮰IgM具有此特性以来，多达几十种硬骨鱼IgM被报道具有类似的结构多样性[11,14,24-29].但是目前硬骨鱼IgM同质异构体产生的功能原因、目的及调控机制一直尚不清楚.

1.1IgM结构的多样性

硬骨鱼四聚体IgM具有一个独特的物理化学性质：同质异构体[14,20,24].其结构多样性的产生是由于IgM单聚体(如虹鳟鱼)或半聚体(如斑点叉尾鮰)重链C末端二硫键交联聚合程度的不均一性[20,24].四聚体IgM中二硫键的不完全聚合，表明了哺乳动物的多肽合成质量控制理论并不适合硬骨鱼IgM的合成组装.硬骨鱼四聚体IgM的同质异构体是通过其自身独特的组装合成过程形成的.不均一的二硫键交联表明其蛋白质内二硫键处于不同的氧化或还原状态，因此同质异构的硬骨鱼IgM四聚体又被称为氧化还原体[24].

硬骨鱼四聚体IgM同质异构体性质具有普遍性.早在1981年，Lobb等[20]首先通过变性非还原的电泳方法证实了斑点叉尾鮰四聚体IgM具有同质异构的结构多样性.通过上述方法，四聚体IgM可获得多达8条不同分子量的条带，最小的是半聚体，最大的是四聚体[29].此后，有多达30种不同的硬骨鱼四聚体IgM被发现也具有相类似的同质异构体[14,20,25,27,30].但是在不同硬骨鱼种类之间，其IgM同质异构体的结构多样性具有一定的差异：如在变性非还原电泳情况下，羊头鲷IgM只显示2条带，二聚体和四聚体；鳣鱼IgM显示有3条带，单聚体、二聚体和四聚体；而三文鱼和虹鳟鱼IgM显示有4条带，单聚体、二聚体、三聚体和四聚体[14,20,24,29].目前，导致不同硬骨鱼IgM同质异构体结构产生差异的原因尚不清楚.Bromage等[11]在虹鳟鱼中发现IgM同质异构体在不同组织中存在结构差异，表明这很可能是生理调控过程的结果.

硬骨鱼中不同类型的免疫球蛋白(IgM、IgD、IgT&IgZ和IgM-IgZ)相继被报道[6-8,29,31].因此，以上已用电泳方法证实的硬骨鱼IgM结构多样性有可能是因为不同类型的免疫球蛋白相混合而产生的.硬骨鱼IgM的结构多样性现已经分别在分子和免疫化学水平上被证实[24,32].在分子水平上，通过将斑点叉尾鮰IgM重链CH基因嵌合于小鼠的VH基因上而构造一条完整的嵌合重链，Ledford发现小鼠B细胞可以利用这条嵌合重链合成类似斑点叉尾鮰IgM所有的氧化还原体[33]，证实硬骨鱼IgM只需一种重链就能合成所有的同质异构体.另外，Kaattari等[24]采用2D电泳方法在免疫化学水平上也证实一个B细胞克隆分泌的英文的字体统一改为同时拥有所有的氧化还原体，表明产生同质异构体并不需要由不同的B细胞所分泌的IgM组成.

1.2IgM的功能

IgM普遍存在于几乎所有脊椎动物中.在血清中，未与抗原接触时，IgM作为一种天然的抗体存在[4].在脊椎动物的不同物种中，IgM均有相应的免疫特点，如：在哺乳动物中，IgM是第一个引起同型转换的免疫球蛋白；并可在适应性免疫和先天性免疫中发挥作用[2,4].另外，在哺乳动物和鱼类中，IgM参与完成许多效应功能，如：补体固定[34]、凝集作用、甘露糖结合凝集素[3]和调理细胞毒作用[34].其中，凝集作用能够吞噬和清理病原体，而补体的激活则有助于病原菌的调理素作用，同时还衔接了先天性和适应性免疫系统.

硬骨鱼特异性IgM抗体可以调动补体作用于人为的表位标记的红细胞与特异性抗原反应，还能够杀灭或中和细菌性病原体,如杀鲑气生单胞菌、寄生虫Cryptobiasalmositica、传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)和病毒性出血败血症病毒(VHSV).硬骨鱼IgM抗体也被证实介导抗原特异性的调理作用和细菌病原体的吞噬作用，比如吞噬弗朗西斯氏菌和美人鱼发光杆菌.

1.3IgM结构多样性的功能解释

抗体的结构和功能紧密相关.在哺乳动物中，多聚体的IgM主要是以完全聚合的五聚体形式存在，同时有一部分IgM是以六聚体结构的形式被表达分泌的，而与这些多聚体IgM相结合的补体系统中的第一个因子C1q却只有六聚体一种结构.研究发现哺乳动物六聚体IgM结合C1q、激活补体系统的能力是五聚体IgM的100倍[35]，表明机体可能是通过表达不同比例的五聚体和六聚体IgM来调控补体系统被激活的程度.

硬骨鱼四聚体IgM的同质异构体具有结构多样性，而同质异构体之间的物理化学差异是重链C末端的二硫键的聚合程度的不同[14,24,29].Kaattari等[24]推测二硫键聚合程度越好的四聚体IgM其刚性越强，而二硫键聚合程度越差的IgM其灵活性越好；并且二硫键的聚合程度可能会影响IgM的生物效应功能(如：补体激活、Fc受体的结合能力等).虽然硬骨鱼IgM的结构多样性(四聚体的同质异构体)与哺乳动物IgM的结构多样性(五聚体和六聚体形式共存)有一些差异，但基于同样原理推测，硬骨鱼四聚体IgM同质异构体的灵活性不同，可能影响它们结合硬骨鱼C1q及激活补体系统的能力.

硬骨鱼IgM结构和功能的亲和力驱动调控研究，对硬骨鱼IgM结构多样性的产生给出了一个初步的功能解释：即BCR结合抗原的亲和力越大，其分泌抗体的二硫键聚合得越好，且其半衰期越长，从而进一步增强亲和力成熟[14,25].在虹鳟鱼IgM的C末端，也有一个很类似哺乳动物IgM的糖基化位点Asn563的糖基化位点Asn569，这个位置临近于四聚体形成所必需的半胱氨酸(C578)位点.对Con A的研究发现，抗体亲和力大的单聚体C末端之间二硫键聚合程度水平高的虹鳟鱼IgM，其甘露糖糖基化水平也较高[14]，表明虹鳟鱼IgM的C末端存在不同程度的糖基化，临近半胱氨酸的聚糖糖基很可能会抑制二硫键的形成，从而导致二硫键聚合程度的不同.然而，硬骨鱼四聚体IgM的同质异构体是否影响其它生物效应功能仍有待于深入研究.

2　IgM抗体分泌细胞

2.1抗体分泌细胞的体外分析

为了探究抗体应答反应的产生机制，需要对抗体分泌细胞进行体内的检测追踪和体外的培养观察.最初，免疫反应中抗体分泌细胞的检测是利用噬菌斑试验[36]，后应用于鱼类抗体分泌细胞的研究[37]，可检测的抗原包括蛋白质、多糖，甚至是致病菌.1983年，Sedgwick和Holt[38]建立的固相酶联免疫技术(ELISPOT)技术极大地促进和提高了检测抗体分泌细胞对于各种抗原的反应能力.目前，ELISPOT技术已经应用在多种鱼类抗体分泌细胞的检测中，包括鲤鱼、斑点叉尾鮰[39]、虹鳟鱼、湖拟鲤等.在抗体分泌细胞的区域性和动力学方面，量化监测抗体分泌细胞在免疫组织中时空的变化，为研究免疫机制提供了一个新的思路.Lin等[40]用人丙种球蛋白腹腔注射免疫比目鱼，检测了抗体分泌细胞动力学.诱导的抗体分泌细胞的区域性可用来解释说明血清抗体应答反应的动力学变化.例如，在研究抗TNP抗体反应的动力学中发现TNP-LPS(T细胞非依赖性型抗原)比TNP-KLH(T细胞依赖型抗原)反应更快，尽管抗体效价会最终会达到一个相类似的水平；然而参与TNP-LPS反应的抗体分泌细胞主要是分布在外周血中，而TNP-KLH特异性的抗体分泌细胞主要是分布在头肾中[40].

抗体分泌细胞的可视化和硬骨鱼淋巴细胞的成功培养使对抗体分泌细胞的研究可从细胞和分子等水平上开展.抗体分泌细胞的体外培养不仅要有一个合适的培养基，而且还需提供未免疫B细胞启动特定抗原反应所需要的辅助细胞和细胞因子等.研究证实蛋白质抗原TNP-KLH引起的抗体分泌细胞反应过程中需要T细胞和巨噬细胞的辅助，而像LPS抗原(T细胞非依赖性的)只需最低辅助(不需上述细胞辅助)就可以诱导[41].现已在头肾、脾脏、外周血、中肾以及胸腺等免疫组织中发现可诱导的B细胞.

2.2抗体分泌细胞亚群：浆细胞和原浆细胞

长期以来，比较免疫学学者通常将硬骨鱼所有的抗体分泌细胞归类为浆细胞[42-44].根据细胞和分子特征定义，虹鳟鱼表达不同亚群的抗体分泌细胞[26,45-47].硬骨鱼的抗体分泌细胞可以分为原浆细胞(具有复制能力、抗体分泌能力低，有BCR)和浆细胞(不能复制，分化末端细胞，抗体分泌能力强，无BCR)[45-47].其中，浆细胞又可以分为2种亚群：短寿命浆细胞和长寿命浆细胞.这2个亚群不仅具有不同的细胞寿命，也具有不同的B细胞起源和抗原亲和力.在哺乳动物中，高亲和力的细胞遇到抗原活化分化成短寿命浆细胞[48]；而低亲和力的B细胞活化后经历突变和亲和力成熟过程，最终分化成高亲和力浆细胞并迁移到骨髓，在适合微环境下存活成为长寿命浆细胞[49-50].虹鳟鱼原浆细胞和浆细胞的最初区分是依赖于细胞周期抑制剂羟基脲(HU)，其作用原理是可逆地阻止淋巴细胞停留在细胞周期中的G1/S期.一旦HU从原浆细胞的培养基中移除，它们可以继续其细胞周期.利用这个原理，可研究在多细胞系中原浆细胞的产生，LPS刺激虹鳟鱼外周血、脾脏和头肾细胞后[26]，发现在不同的组织中不同抗体分泌细胞具有不同比率.

虹鳟鱼的静息B细胞、原浆细胞和浆细胞可以用浮力密度离心法来分离，并且可用分子标记来区分不同种类的B细胞[45].结果显示，70% Percoll分离的小而密集的是B细胞，60%分离的较大和较不密集的为原浆细胞，而50%分离的最大、最稀疏的是浆细胞.对于不同密度的细胞进行标记表达的分析显示，高密度细胞高水平的表达Pax5，但是浆细胞不表达.这些细胞同时表达高水平的膜结合型IgM(mIgM)，而不表达B淋巴细胞诱导的成熟蛋白-1 (Blimp-1)，从mIgM转移成sIgM[51].与之形成鲜明对比，低密度的细胞不表达Pax-5或mIgM，但是具有高的Blimp-1和sIgM(即含有浆细胞).中间密度的细胞含有中间水平的标记表达.基于细胞的密度特征，采取另外一种方法，在分离的mIgM不同表达水平的基础之上进行了B细胞分析[46].按照时间的安排暴露于抗IgM的磁珠上，它们分离出的细胞带有高、中、低3种mlgM水平，即分别对应为原始B细胞、原浆细胞和浆细胞.具有最高水平mlgM的也具有较高水平的Pax-5，而那些具有最低mlgM也相应含有低水平的Pax-5.这种分析可用于B细胞在不同免疫组织起源的推测.

3　IgM记忆性细胞：体液免疫记忆

3.1长寿命浆细胞

近年来，仅由记忆性B细胞形成来维持免疫记忆的模型在理论上和实验上均被质疑[52-53]，因为在小鼠实验中证实长寿命浆细胞确实存在并维持长期血清抗体水平.另外采用体内记忆B细胞消耗法也证明，相当一部分浆细胞在无相应记忆B细胞存在时依然长期存在、且持续分泌大量抗体[52-53].这种由长寿命浆细胞提供的体液免疫记忆，只需要初次抗原刺激即可形成并长期存活，持续大量地产生抗体来长期维持血清抗体的效价水平，从而为机体提供免疫保护[17,53-56].以虹鳟鱼为研究对象，通过体外细胞培养加入B细胞周期抑制剂羟基脲的方法，发现长寿命浆细胞在硬骨鱼中的存在.体外培养时，虹鳟鱼长寿命浆细胞的寿命可长达2周以上，而在体内则可以长期存活[14,26,40,57].初次注射免疫后，在2年的连续观测中，发现虹鳟鱼特异性长寿命浆细胞形成稳定后其数量并未发生明显变化[14].同时，长寿命浆细胞长期存活和机体长期维持血清抗体效价呈线性正相关，表明长寿命浆细胞是维持体液免疫记忆的原因[14,26,40,57].

哺乳动物长寿命浆细胞的形成除了起源于生发中心，也来自于淋巴小结间区，在相关细胞因子和受体信号的作用下大部分迁移归巢至骨髓(80%～90%)中长期存活，少量存在于脾脏及一些外围黏膜组织[58-63].虹鳟鱼中特异性长寿命浆细胞开始大量出现于免疫后10周左右，在20周左右峰值最高，其后维持相对的稳定[14,26,40,57].长寿命浆细胞主要分布在头肾(类似于哺乳动物的骨髓组织)，部分存在于后肾及脾脏等组织；长寿命浆细胞是否存在于鱼类皮肤黏膜中尚不清楚.Kaattari实验室应用注射免疫途径研究了长寿命浆细胞在虹鳟鱼主要免疫器官(包括头肾、后肾和脾脏等)中的形成分布及迁移[14,26,40,57]，而Zhao等[38]采用浸泡免疫途径研究叉尾鮰皮肤黏膜中的浆细胞的形成分布.哺乳动物骨髓中适合长寿命浆细胞生存的微环境的总量是相对恒定的，并且不同抗原特异性的长寿命浆细胞会相互竞争并共存于骨髓中[15].但是关于硬骨鱼长寿命浆细胞的竞争存活机制还未见报道.

3.2记忆性B细胞

“体液免疫记忆”是指由长寿命浆细胞持续产生的抗体反应，但在本节中，则侧重于二次免疫引起的免疫记忆应答.与硬骨鱼相比，哺乳动物二次应答中抗体效价及亲和力呈对数增长，发生抗体类型的转换和B细胞对诱导抗原的更高敏感性以及免疫应答的持久性.早期研究发现再次免疫时，硬骨鱼抗体的效价和亲和力只略微升高[64]，从而认为鱼类可能无法产生记忆反应.但近期研究证实硬骨鱼的抗体效价和亲和力，以及对抗原敏感的淋巴细胞池都能发生呈对数性增加[14,65].

硬骨鱼和哺乳动物的免疫记忆有一个共同特点，即初次免疫后，会形成一个巨大的记忆池.相比于哺乳动物，硬骨鱼的记忆池可能更为庞大.与哺乳动物相同的是，硬骨鱼记忆细胞也是主要存在于外周血中.然而，哺乳动物的γ记忆细胞具有更大的克隆增生潜能，而硬骨鱼类克隆性增殖的潜能似乎不变.最近的研究结果表明，T细胞依赖性抗原(TNP-KLH)或T细胞非依赖性抗原(TNP-LPS)诱导产生记忆池的能力相当.这些记忆细胞是来自于复制一部分原浆细胞分化的结果[66].外周血中产生的记忆细胞有实践性的作用，即可以很容易地通过体外培养定量地检测到潜在的记忆反应.通过这种方法，已成功完成了人用疫苗的临床试验.因此，可以通过对由接种疫苗得到的血样来评估传统的记忆细胞(记忆性B细胞产生)和体液记忆细胞(抗体产生).

4　亲和力成熟

亲和力驱动选择在浆细胞的发育过程中具有重要的作用.如上文所提到的，抗原高亲和力的原始B细胞在向抗体分泌阶段发展中，可能只分化成为短寿命浆细胞，而低亲和力的B细胞则在囊泡内经历了高频率突变和抗原驱动的选择.最终，这些最初低亲和力B细胞分化成为具有很高亲和力的浆细胞，在骨髓特定生态微环境中长时间存活下来并持续地分泌抗体.这种高亲和力抗体的产生，以及高亲和力长寿命浆细胞在骨髓微环境中的存活也提供了促进抗体亲和力成熟的机制.

有趣的是，通过以酶联免疫分析为基础的亲和力ELISA对虹鳟鱼血清IgM抗体亲和力成熟的分析显示虹鳟鱼中存在类似的机制，发现血清抗体亲和力的一个重大转变就恰好与头肾中长寿浆细胞的发展相一致(大约免疫后12～15周).亲和力分区的酶联免疫检测结果表明高亲和力的抗体亚群要比先前的低亲和力抗体亚群持久稳定得多[14].此外，抗体效价与总抗体分泌细胞的数目比例揭示了当头肾中的长寿命浆细胞占据抗体分泌细胞主导地位时，分配比率发生重大的转变，表明此时大多数抗体分泌细胞是长寿命的，其具有高分泌能力、能分泌高亲和力抗体.

5　展望

硬骨鱼IgM结构和功能的亲和力驱动调控机制的发现是对经典免疫学理论的新补充.同时，也具有重要的实践应用价值，如精确有效地调控更多疫苗特异性的、高亲和力的、免疫保护力好的、结合病原抗原能力强的IgM抗体的分泌，从而使机体达到较佳的免疫防御保护力.继续探究基于亲和力的硬骨鱼四聚体IgM同质异构体的生物效应功能的差异和细胞调控机理将有助于诠释了一个未知的、复杂免疫系统中抗体结构和功能关系的新理论.硬骨鱼B细胞很可能为生物研究提供一种新颖的实验研究模式和途径，就是单一的细胞，通过调整其与配体(抗原)结合亲和力的大小，来控制分泌蛋白(抗体)的结构修饰，从而影响分泌蛋白的生物功能.这种模式很可能同样适用于其它糖基化的免疫球蛋白类型，和其它的受体/配体系统.

在理解认识硬骨鱼免疫系统应答能力上，还需要对其细胞学结构和分布有一个精确认识.今后的研究将在分子生物学和细胞学上进一步深入，以相对明确的模式小鼠和人为参考，确定硬骨鱼中是否存在可比性的B细胞分化路径，开发诸多的细胞因子、受体和配体探针.如何调控长寿命浆细胞到达它的生态位点？什么因素影响浆细胞的寿命？寿命长短是否与不同特异性浆细胞竞争有限的生态位点相关联？或者是否存在维持特定浆细胞的长期机制？这些问题都需要深入研究.

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【中文责编：成文英文责编：李海航】

Teleost IgM Structure, Function and Humoral Immune Response

Ye Jianmin*, Wang Yuhong, Ding Mingmei, Yin Xiaoxue

(Guangdong Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture, College of Life Science,South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Two classical immunological paradigms have been operated to govern the development and functionality of the antibody response: (1)affinity maturation is primarily dependent upon antigen-driven selection of both the germline and somatically amended high affinity repertoires, and (2) antibody effector function is isotypically determined. Recent findings, utilizing the teleost IgM model, suggest that these classical paradigms should be broadened to incorporate the ability of the immune system to transducer the strength of antigen recognition (affinity) into isomerism structural modification that, in turn, modulate the half-life of antibody in serum. More importantly, the discovery of teleost unique feature reveals a heretofore unknown level of sophistication by which the immune system can interpret and response to the antigenic universe. The aim of this paper is to introduce key findings of recent studies in the functional explanation and cellular regulation of the affinity-induced teleost IgM isomerism, the mechanisms of long-lived plasma cells, short-lived plasma cells, plasmablasts and memory B cells on maintaining the teleost humoral immune response. Upon resolving the mechanisms of affinity-induced teleost IgM isomerism and its humoral memory response, more cogent vaccine designs could be effectively developed and more precise system to evaluate the protective efficiency of vaccines will be established.

teleost; IgM; affinity; isomerism; humoral immune response

2015-06-14《华南师范大学学报(自然科学版)》网址：http://journal.scnu.edu.cn/n

国家自然科学基金项目(31172432,31472302)；广东省自然科学基金项目(2014A030313437)

叶剑敏，青年千人计划获得者，教授，Email: yjmying@126.com.

Q954

A

1000-5463(2015)05-0001-08