不同动物源性维氏气单胞菌生物学特性比较研究

单晓枫 ，康元环，夏京津，龙继兵，陈 龙，王 惠，曹 亮，孟庆峰，钱爱东

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.吉林出入境检验检疫局，吉林 长春 130062）

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii，AV）是一种人-兽-鱼共患病原菌，其广泛存在于水体及土壤之中，是动物肠道和自然生态系统的正常菌群之一[1]。该菌有致病性菌株与非致病性菌株之分，近年来，有关致病性菌株所引发的人、哺乳动物、水生动物疾病的报道逐渐增多，严重威胁了人类的健康，并给养殖业尤其是水产养殖业带来巨大的损失[2-6]。但是，有关维氏气单胞菌的研究在国内尚处于起步阶段，尤其缺少系统性与深入性的研究。鉴于此，本试验选取8 株不同动物源性的维氏气单胞菌，并对其染色特性、理化特性、培养特性、耐药性、不同pH值、温度、渗透压对其生长的影响以及16SrRNA序列的相似性等生物学特性进行比较研究，研究结果，将为维氏气单胞菌的检验检疫、疾病预防奠定基础，同时为该菌的深入研究提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 菌种 维氏气单胞菌WL161 株（乌鳢源）、NJ4112-4株（鲫鱼源）、NC4122-3株（草鱼源）、NN725株（鲶鱼源）、CY0806 株（鲤鱼源），由吉林农业大学实验室分离并保存；CVCC3700 株（狐源），购自中国兽医药品监察所；QXF0711B株（青虾源）由浙江省淡水水产研究所潘晓艺副研究员惠赠；标准株ATCC35624（人源）为本实验室保存。

1.2 主要试剂TaqDNA聚合酶、DL-2 000 DNAMarker，购自TaKaRa 公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收DNA试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；RS鉴别培养基，购自北京陆桥生物技术有限责任公司；HE 培养基、S.S.培养基、EMB培养基、BS培养基、麦康凯培养基、TSA培养基、TSB培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；细菌微量生化反应管、抗菌药物药敏试纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 菌种的复苏 将实验室保存的8株维氏气单胞菌冻干粉，接种于TSB培养基中，30 ℃培养18～24 h，将菌株复苏，取该复苏菌液划线接种于RS鉴别培养基，30 ℃培养18～24 h 后挑取特征性菌落再次接种于TSB培养基中，30 ℃培养18～24 h，保存备用。

1.4 菌体形态特征观察 将复苏并纯化的8 株维氏气单胞菌接种于TSB培养基中，待生长至对数生长期及老龄期时，进行革兰染色，显微镜观察其菌体形态。

1.5 理化特性 将复苏的维氏气单胞菌分别接种于微量生化反应管中，其中CVCC3700株、ATCC35624标准株于37 ℃培养，其余菌株30 ℃培养，具体操作参见微量生化反应管说明书。

1.6 培养特性观察 取复苏的细菌分别划线接种于HE 培养基、S.S.培养基、EMB培养基、BS培养基、麦康凯培养基、TSA培养基、RS培养基、TCBS培养基等8种不同琼脂平板上，CVCC3700株、ATCC35624标准株于37 ℃培养24 h，其余菌株30 ℃培养24 h，观察并记录菌落形态。

1.7 不同pH 值、温度、渗透压对细菌生长的影响将复苏的菌液稀释至一定浓度，接种于TSB培养基中，观察不同pH 值、培养温度、渗透压等对不同源性维氏气单胞菌生长的影响，具体操作参照参考文献[7]。

1.8 药敏试验 选取22 种抗生素的药敏纸片，分析不同源性维氏气单胞菌对抗生素的耐药性，具体操作按药敏纸片说明书进行。

1.9 16SrRNA序列的测定与遗传演化分析 以不同菌株的基因组DNA为模板，引物为细菌16SrRNA的通用引物（27F、1492R），进行PCR 扩增，PCR 反应产物经纯化后，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果通过BLAST 进行比对，并使用Mega4.0 软件构建系统发育树进行分析。

2 结果

2.1 菌体形态特征观察 经革兰染色、镜检，8 株不同源性的维氏气单胞菌在对数生长期菌体形态差异不大，均为革兰阴性短杆菌、单在或成对、略有弯曲，部分菌株（CVCC3700 株、WL161 株）在对数生长期即呈现多形性、长丝状与短杆状并存；在老龄培养物中均出现多形性现象，但长丝状菌体形态所占比例的多少、不同菌株存在一定差异。

2.2 理化特性 8 株不同维氏气单胞菌菌株的理化特性基本一致，酒石酸盐、明胶液化、D-甘露醇、赖氨酸脱羟酶、D-半乳糖、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羟酸、DNA酶、D-葡萄糖产酸、蔗糖、麦芽糖、ONPG、吲哚、V-P 试验、硝酸盐还原、氧化酶等均为阳性反应；硫化氢、尿素水解、苯丙胺酸脱氨酶、乳糖、L-阿拉伯糖、甘油、肌醇、卫茅醇等为阴性反应；但枸橼酸盐利用、水杨素、七叶苷、M.R.等因菌株不同而存在差异。

2.3 培养特性观察 8 株不同源性维氏气单胞菌经不同培养基培养24 h 后，分别呈现不同的菌落特征、且不同菌株在同一培养基上的菌落形态基本一致（表1），但在RS鉴别培养基上：ATCC35624株菌落呈现暗绿色、CY0806 株菌落呈现黄色、其余呈现淡黄色菌落。

2.4 不同温度对维氏气单胞菌生长的影响 将8株维氏气单胞菌复苏、稀释至一定浓度、接种于TSB培养基中，分别于25 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃恒温培养24 h，4 ℃培养7 d。结果如下：在25 ℃～40 ℃范围内，除ATCC35624 株、CY0806 株每毫升的活菌含量略有下降外，大多数菌株生长良好；在42 ℃，所有菌株的生长都略受到抑制，但仍可生长繁殖；在4 ℃培养7 d，所有菌株均可生长繁殖。

表1 维氏气单胞菌在不同培养基的生长特征

2.5 不同pH 值对维氏气单胞菌生长的影响 将复苏的8 株维氏气单胞菌接种于不同pH 值的TSB培养基中、30 ℃培养24 h，得到如下结果：所有菌株均可在pH 值6～9 范围内存活并生长，少数菌株（WL161、CY0806）可以耐受pH 值为4、5 或10 的酸碱。

2.6 不同渗透压对维氏气单胞菌生长的影响以氯化钠添加量为渗透压的试验量、接种复苏的维氏气单胞菌，结果显示，所有菌株均可在氯化钠含量为0%～4%的TSB中生长良好、在6%氯化钠中不能存活；部分菌株（ATCC35634、WL161、NN725、CY0806）可以耐受5%的氯化钠含量。

2.7 药敏试验 8 株维氏气单胞菌均对青霉素G、克林霉素、万古霉素、多粘菌素B、氨苄西林、新生霉素等表现出耐药性；对头孢克肟、洛美沙星、头孢曲松、奥复星、单环菌素等比较敏感；对其余的抗生素则因菌株差异、耐药性也不尽相同；其中菌株NN725对多种抗生素表现出耐药性（表2）。

2.8 不同动物源维氏气单胞菌16SrRNA基因遗传演化分析 利用MEGA5.1 软件对不同动物源维氏气单胞菌16SrRNA基因的遗传演化进行分析：ATCC35624、NC4122-3、WL161 亲缘关系较近处于同一大分支；其余5 株聚成一簇、处于一大分支。

图1 不同宿主来源维氏气单胞菌16SrRNA基因进化分析

3 讨论

作为一种较新型的人-兽-鱼共患病原菌，维氏气单胞菌引发多种动物疾病的报道日益增多[1-6]，但有关其生物学特性的报道并不多见，本实验室曾对一株鲤源维氏气单胞菌的生物学特性进行了初步探讨[7]，但不同源性维氏气单胞菌的生物学特性是否相似，则尚未见研究报道。因此，本研究针对实验室保存的8 种不同动物源性的维氏气单胞菌生物学特性进行研究，旨在为深入研究该菌提供一些数据支持。

表2 8株维氏气单胞菌的耐药性

本研究首先对其菌体形态进行了初步观察，结果发现，维氏气单胞菌在老龄培养物中，多数菌株呈现多形性-即短杆状与长丝状并存，其中CVCC3700株、WL161 株尤为明显，其在对数生长期就表现出了多形性。本实验室曾对环境中分离的维氏气单胞菌菌体形态进行了观察，发现细菌的多形性是一种比较常见的状态，这种情况在其他气单胞菌尚未发现，是否可以作为检测维氏气单胞菌的一个条件，仍需进一步大量菌株进行论证。

对维氏气单胞菌的培养特性进行了研究，从结果中可以看出，该菌可以在多种鉴别培养基上生长良好，这与本实验室曾经的研究结果相符[7]，但值得注意的是，不同源性的维氏气单胞菌在RS培养基上的菌落形态与颜色并不一致，这提醒我们在分离维氏气单胞菌时，选用的鉴别培养基应该慎重。

从不同培养温度、pH值以及渗透压对维氏气单胞菌生长影响的结果可以看出，维氏气单胞菌可以在较为广泛的温度、盐度较高或者无盐的环境中存活并生长；个别菌株还可以耐受较强的酸碱环境；尤其应当引起注意的是，维氏气单胞菌可以在4 ℃条件下缓慢生长，这与González-Rodríguez 与Castro-Escarpulli 的研究结果相符[8-9]。综合维氏气单胞菌耐受能力测定结果说明，该菌的生存空间广泛，不同环境中的动物、人均有可能接触、甚至患病，因此研究结果具有一定的公共卫生意义。

8 株维氏气单胞菌对抗生素的耐药性结果不尽相同，可能与菌株来源不同有着直接关系。其中，鲇鱼源NN725 株的耐药种类较多，说明抗生素的滥用会导致多重耐药菌株的出现，这应当引起人们的足够重视。

虽然8 株维氏气单胞菌16SrRNA基因序列有着较高相似性，但仍然存在着一定差异，不过这种差异有着一定的随机性，与动物源性或者地域差异并不相关。

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