山羊化脓隐秘杆菌的分离鉴定与分析

张素辉，付利芝，黄勇富，沈克飞

（1.重庆市畜牧科学院，重庆 荣昌402460 ；2.重庆市山羊工程技术研究中心，重庆 荣昌 402460；3.西南大学动物科技学院，重庆 北碚 400716）

化脓隐秘杆菌,原称化脓棒状杆菌（Corynebacterium pyogenes）、化脓放线菌（Actinomyces pyogenes），1997 年定名为化脓隐秘杆菌（Arcanobacterium pyogenes），根据其16SrRNA的基因序列的分析结果，将其归入隐秘杆菌属更为恰当[1]。该菌最早（1893）从牛的脓汁中分离到，为条件性致病菌[2]；可在家畜间广泛传播，是一种对反刍家畜和猪非常重要的共生条件性致病菌。当动物处于应激状态，如运输、寒冷、断奶及其他异常条件刺激时，致使机体抵抗力下降，体内的化脓隐秘杆菌或已处隐性感染情况下的化脓隐秘杆菌大量增殖，加强致病作用而引起发病或恶化[3-4]。常导致广泛多样的皮肤、内脏器官和关节的非特异性化脓性感染，如牛、羊、猪乳房炎、关节炎、心内膜炎、肝脓肿、子宫炎以及流产等病理变化，严重时，常因脓毒败血症而死亡。已证实化脓隐秘杆菌是牛呼吸道疾病综合征重要的细菌性病原之一[5]。

在重庆地区未见有关于化脓隐秘杆菌对羊只危害的相关报道，本研究从羊只病变的肝脏、肺脏和心血组织中成功培养并纯化出化脓隐秘杆菌，并对其进行了鉴定分析，为进一步研究其致病机理、诊断技术和疾病控制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物 20 日龄左右的小鼠，购自重庆腾鑫生物技术有限公司。

1.2 试验试剂 小牛血清、PCR反应试剂2×TaqPCR Master Mix、DNA抽提试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，均购自天根生化科技（北京）有限公司；青霉素等28种药敏纸片，购自上海卫生技术服务公司；细菌16SrRNA引物，由宝生物工程（大连）有限公司合成；引物序列为：27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACCTTGTTAC-GACTT-3′[6]。

1.3 病原菌的分离纯化 对病死羊只的肺脏、肝脏病变部位和心血组织进行无菌划线接种于普通营养琼脂平板和小牛血清琼脂平板上，37 ℃恒温培养24～96 h，观察细菌的生长情况，并将分离到的菌株进行纯化培养。

1.4 生化特性鉴定及致病性试验 将分离菌接种肉汤培养基，37 ℃震荡培养72 h 后接种微量生化反应管，于37 ℃培养24～48 h 观察分离菌生化特性。同时取菌液调整浓度至1×109CFU/mL，经腹腔注射0.2 mL/只菌悬液3 只；设生理盐水对照2 只及空白对照1 只。连续7 d 观察小鼠精神状态、活动状况及临床症状，并对死亡动物进行剖检、细菌分离培养及病原鉴定。

1.5 药敏试验 参照美国临床实验室标准化委员会标准，采用纸片法做药敏试验。检测该菌对氨苄青霉素等28 种抗生素的敏感性，抑菌圈直径＜10 mm表示其对抗生素具有一定的耐药性，10～15 mm的为中度敏感，＞15 mm 的为高度敏感。

1.6 病原菌16SrRNA的PCR 扩增测序 参照文献[7]进行。

1.7 系统进化分析 病原菌的16SrRNA序列测序结果经Blast 比对后，借助MEGA软件，利用Neighbor-Joining 方法将所得序列与GenBank 中已知相关性较高菌株的16SrRNA序列进行比对分析，各代表菌株相关信息如表1，构建系统发育进化树。

表1 系统发育树的代表菌株及16SrDNA序列信息

2 结果

2.1 病原菌对山羊组织病变的影响 感染了该病原菌的羊只肝脏和肺脏出现了不同程度的出血症状，胸腔黏膜表面局部有化脓灶。见中插彩版图1 所示。

2.2 病原菌的形态特征 分离菌对营养需求较高，在普通琼脂平板上生长十分缓慢，培养72 h 后仍观察不到菌落；在小牛血清琼脂培养基上生长48 h后，可观察到直径大小约1.0 mm 黏性菌落。挑取单个菌落于小牛血清肉汤37 ℃振荡培养72 h 后革兰染色镜检，镜检结果见中插彩版图2，为细小的革兰阳性菌，菌体呈球状、杆状、丝状等多形态。

2.3 分离菌生化鉴定及致病性试验 生化鉴定结果显示，该分离菌能够利用葡萄糖、乳糖、淀粉等物质，能够液化明胶，而不能利用棉籽糖、山梨醇、尿素等。3只小鼠在接种了病原菌24 h后，均出现精神委靡，反应迟钝的症状，120 h 后2 只死亡，第3 只在接种7 d后死亡，正常对照组小鼠生长状况良好。死亡小鼠肝脏和肺脏明显出血，肝脏表面有化脓灶；腹腔布满化脓液，肠道严重液化。见中插彩版图3 所示。

2.4 药敏试验 该分离菌对氨苄西林、氟苯尼考、丙氟哌酸、卡那霉素、强力霉素、奥复星、利福平、阿奇霉素、新霉素、庆大霉素、头孢曲松、头孢呋辛、诺氟沙星、恩诺沙星、培氟沙星、先锋霉素Ⅴ、先锋霉素Ⅵ、先锋必、淋必治、痢特灵敏感，对甲氧苄啶、四环素、红霉素、洁霉素、复方新诺明、磺胺异恶唑、克林霉素、乙酰螺旋霉素均表现出明显的耐药性。

2.5 病原菌16SrRNA序列的扩增与分析 将测序后的分离菌16SrRNA基因序列登录到GenBank，登录号为KJ842125。同时在GenBank 进行序列比对，发现其与化脓隐秘杆菌（Arcanobacterium pyogenes，登陆编号为HQ712123）同源性高达98%；在系统进化发育树种也与其聚为一簇，且自展值为99，可信度较高，进化树结果如图4 所示。

图4 基于16SrDNA序列构建的系统发生树状图

3 讨论

化脓隐秘杆菌是一种条件致病菌，对不同的宿主可能造成不同程度的病理变化，其危害机体可能与多种毒力因子有关，目前，报道最多的主要有化脓隐秘杆菌溶血素（PLO）、胶原结合蛋白（CbpA）、神经氨酸酶（Nan）和菌毛结合蛋白（Fim）等4 类，这些毒力因子主要影响动物机体的红细胞、免疫细胞、功能蛋白等功能的发挥，从而降低机体免疫力，破坏免疫屏障，而常引起不同病原菌的混合感染[8-9]。

目前，关于化脓隐秘杆菌报道最多的是其对牛和猪的危害，其对羊的致病性研究相对较少，本研究利用细菌常规分离鉴定的方法，将临床病原菌的分离鉴定与分子生物学诊断技术相结合，从山羊的病变组织中成功分离到了化脓隐秘杆菌，毒性试验表明，其对小鼠有较强的致病性，化脓性病变较为明显[10-11]。以上研究为进一步探讨其毒力因子的作用机理和致病性奠定了基础，也为研究由化脓隐秘杆菌引起的山羊感染性疾病的防治措施提供了理论依据[12]。

[1]Jost BH，Billington SJ.Arcanobacterium pyogenes：molecular pathogenesis of an animal opportunist[J].Antonie van Leeuwenhoek，2005，88（2）：87-102.

[2]刘明春，刘耀川，赵敬翠，等.奶牛子宫内膜炎化脓隐秘杆菌16SrRNA基因的鉴定与分析[J].中国兽医学报，2009，29（3）：343-345.

[3]Silva E，Gaivao M，LeitJo S.et al.Genomic characterization of Arcanobacterium pyogenes isolates recovered from the uterus of dairy cows with normal puerperium or clinical metritis[J].Vet Microbiol，2008，132（1-2）：111-118.

[4]芮萍，马增军，陈翠珍，等.猪化脓放线菌的分离与鉴定[J].中国兽医杂志，2004，40（9）：33.

[5]鲁杏华，何世成，谈志祥，等，猪化脓隐秘杆菌的分离与鉴定[J].中国畜牧兽医，2009，36（5）：149-151.

[6]Jeremy AF，Claudia I R，Shobha Sharma.et al.Critical Evaluation of Two Primers Commonly Used for Amplification of Bacterial 16SrRNAGenes[J].Appl Envir Microbiol，2008；74：2461-2470.

[7]张素辉，黄勇富，付利芝，等.山羊源奥斯陆莫拉菌的分子鉴定与分析[J].中国人兽共患病学报，2014，30（1）：12-16.

[8]田凯，王秋霞，郭文洁，等.化脓隐秘杆菌溶血素的研究进展[J].中国兽医杂志，2010，46（12）：65-67.

[9]郭文杰，赵敬翠，刘耀川，等.化脓隐秘杆菌毒力因子的研究进展[J].中国兽医杂志，2010，46（1）：52-53.

[10]冯峰.山羊化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其对小鼠的致病性试验[D].雅安：四川农业大学，2010.

[11]赵敬翠，李杰，刘耀川，等.化脓隐秘杆菌的特性及化脓隐秘杆菌的防治[J].黑龙江畜牧兽医，2009，06：92-93.

[12]乌仁套迪.猪化脓棒状杆菌病的诊断报告[J].河北农业科技，2007，9：37-38.