膜突蛋白免疫大鼠制造肺动脉高压模型的研究①

王 为 王 迁 李梦涛 曾小峰 (中国医学科学院 北京协和医院 风湿免疫科，北京 100005)

肺动脉高压是结缔组织病(Connective tissue disease，CTD)的严重并发症，它与特发性肺动脉高压(idiopathic pulmonary arterial hypertension，iPAH)同属于肺高压的第一类:动脉型肺动脉高压。两者具有相似的病理改变，即肺动脉平滑肌增生移行，新生内膜及丛样病变形成［1］。目前针对CTD-PAH 的治疗基本借鉴来自iPAH 的动物实验及临床研究结果，但现有观点认为CTD-PAH 具有比iPAH 更为显著的免疫损伤和炎症反应，部分病人在接受激素和免疫抑制剂治疗后肺动脉压力有所降低，提示两者在发病机制上仍存在不同［2］。因此，如能寻找到一种更接近CTD-PAH 发生发展机制的动物模型，无疑会对该疾病的诊治提供巨大帮助。已有临床研究证实抗膜突蛋白抗体与系统性硬化症相关PAH 具有显著相关性［3］。本实验则将探寻膜突蛋白是否可使大鼠出现肺动脉高压。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 成年雄性SD 大鼠35只，体重200～220 g，6 周龄，购自维通利华公司。动物饲养符合《北京市动物实验管理条例》。随机分组:阳性对照组(MCT 组)5 只，空白对照组5 只，佐剂对照组5 只，低剂量膜突蛋白免疫组(250 μg/次)10只，高剂量膜突蛋白免疫组(500 μg/次)10 只。

膜突蛋白原溶液及抗膜突蛋白抗体ELISA 检测试剂盒由上海富纯中南生物技术有限公司提供。野百合碱(Monocrotaline，MCT)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 各实验组的建立方案 (1)阳性对照组:将MCT 诱导肺动脉高压动物模型作为本实验的阳性对照，具体为:第0 天皮下注射MCT(60 mg/kg)。第0 天时通过内眦取血法留取血清，第21 天取大鼠进行肺动脉压力测定，留取血清，处死后留取肺组织标本。(2)蛋白免疫组:用生理盐水将膜突蛋白原溶液分别稀释成为1、0.5 mg/ml，按照1∶1比例与弗氏完全佐剂混匀，获得浓度分别为500、250 μg/ml的蛋白匀液，用于首次免疫;同样的方法将蛋白液与弗氏不完全佐剂混合，所得蛋白匀液用于加强免疫。第0 天时按照相应剂量对大鼠进行首次免疫，第2周和第4 周加强免疫2 次。第0 天时通过内眦取血法留取血清。第6 周时取大鼠进行肺动脉压力测定，留取血清，处死后留取肺组织标本。(3)空白对照组:不做任何处理，饲养条件同实验动物。(4)佐剂对照组:将弗氏完全佐剂/不完全佐剂与生理盐水1∶1等体积混匀，取1 ml 弗氏完全佐剂混悬液用于第0 天的首次免疫，取1 ml 弗氏不完全佐剂混悬液用于第2 周和第4 周的加强免疫。第0 天时通过内眦取血法留取血清，第6 周时取大鼠进行肺动脉压力测定，留取血清，处死后留取肺组织标本。

1.2.2 血流动力学测定 大鼠麻醉后(25%乌拉坦1 250 mg/kg 腹腔注射)，利用BL-420E 生物机能实验系统，通过右心导管测大鼠肺动脉压;采集压力波形后，行颈内动脉插管处放血处死大鼠，取大鼠肺脏病理。

1.2.3 苏木素-伊红(HE)染色及免疫组织化学染色 大鼠组织经固定、包埋、切片、脱蜡和水化后行HE染色，×200 倍视野下对血管外径100 μm 左右的小血管进行评价。应用抗平滑肌抗体对肺组织切片进行免疫组织化学染色，评估肺小动脉肌化的情况。

1.3 统计学处理 数据处理统计学软件采用SPSS20.0，计量资料正态分布描述用±s 表示。用配对t 检验比较同大鼠免疫前后的血清抗膜突蛋白抗体OD 值。比较肺动脉压力时采用独立样本t 检验。P＜0.05 为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 抗膜突蛋白抗体检测 低剂量组大鼠免疫前血清抗体OD 值为0.132 ±0.049，实验终点时血清抗体OD 值为1.903 ± 0.054，差异极显著(P＜0.01)。高剂量组大鼠免疫前血清抗体OD值为0.125 ± 0.042，实 验 终 点 时 为2.031 ±0.046，差异极显著(P＜0.01)。高低剂量组抗体滴度之间无显著差异(P ＞0.05)。佐剂对照组以及阳性对照组大鼠给药前、后血清抗体OD值无显著差异(P 均＞0.05)，证明这两组大鼠体内无抗膜突蛋白抗体产生。

2.2 大鼠肺动脉压力检测及比较 低剂量组和高剂量组大鼠的平均肺动脉压力分别为(20.6 ±2.9)mm-Hg 和(20.7±2.3)mmHg，空白对照组为(15.5 ±0.6)mmHg，蛋白免疫组的mPAP 均高于空白组，差异显著(P=0.002，0.001)，但高、低剂量组之间无显著差异(P=0.93)。佐剂对照组大鼠的mPAP 为(17.2±1.6)mmHg，与空白对照组间无显著差异(P=0.065)。与佐剂对照组相比，蛋白免疫组的mPAP 均升高，差异显著(P=0.03，0.013)。数据表明，经膜突蛋白免疫后，大鼠的平均肺动脉压力明显升高，用于免疫给药的佐剂未对肺动脉压力造成显著影响。但蛋白免疫组的平均肺动脉压力升高不及阳性对照组［(33.9±4.7)mmHg］显著(P 均＜0.01)。

2.3 组织学比较 如图1 所示，蛋白免疫组大鼠肺内出现散在的小血管(外径100 μm左右)管壁增厚、管腔堵塞以及血管周围灶性炎症细胞浸润等表现。但总体上看，实验组大鼠病变血管的出现频率较MCT 组小。200 倍镜下随机采集5 个视野，MCT 组的病变血管约10～15 支，而实验组仅3～5支。免疫组化染色证实，平滑肌增生是造成血管管壁增厚和管腔堵塞的主要原因。

图1 大鼠肺组织HE 染色及免疫组化染色Fig.1 Hematoxylin-eosin and immunochemistry staining of lung tissue

3 讨论

膜突蛋白，又称膜组织伸展棘突蛋白(membr ane-organizing extension spike protein，moesin)，于1988 年首次在牛的子宫平滑细胞中被发现，其理论相对分子质量为68 000，实际相对分子质量为78 000，由577 个氨基酸组成［4］。膜突蛋白通过介导细胞膜与肌动蛋白细胞骨架的连接，在细胞的生长、运动、迁移、有丝分裂以及信号转导等方面发挥重要作用［5］。最初发现抗膜突蛋白抗体可能与CTD-PAH 具有相关性的研究来自于针对抗内皮细胞抗体(Anti-endothelial cell antibody，AECA)的研究［6，7］。AECA 实际上是一组识别血管内皮细胞表面多种抗原的抗体总称，高度异质性限制了AECA的特异性。但有研究发现，AECA 识别的78 kD 抗原条带对CTD-PAH 患者具有较高特异性，经分离纯化鉴定，该抗原为膜突蛋白［8］。临床研究发现抗膜突蛋白抗体与CTD 肺部损伤(PAH＆ILD)具有显著相关性［3］。细胞水平研究结果则显示，抗膜突蛋白抗体可能通过诱导肺微血管内皮细胞早期凋亡和改变细胞骨架结构而引起细胞损伤［9］。因此，无论是临床层面还是基础层面的研究，都提示抗膜突蛋白抗体可能与CTD-PAH 的发生具有相关性。因此，本实验用膜突蛋白免疫大鼠，成功诱导大鼠产生抗膜突蛋白抗体，并证实这些大鼠的平均肺动脉压力较空白对照和佐剂对照组显著升高。病理组织研究发现该组大鼠出现肺小动脉管壁增厚、肌化，管腔堵塞以及血管壁周围炎症细胞浸润等肺动脉高压的典型病理改变，证明抗膜突蛋白抗体的确与肺动脉高压存在相关性。这是目前国内外首个利用蛋白免疫的方法制造出肺动脉高压动物模型的研究。

目前现有的肺高压动物模型有MCT 大鼠PAH模型，慢性低氧诱导PH 模型，肺动脉结扎鼠类模型，基因敲除鼠类模型，以及IL-6、血管生成素或五羟色胺过表达模型等［10］。其中野百合碱诱导大鼠PAH 模型是目前最为常用且成熟的动脉型肺动脉高压动物模型。在给大鼠注射MCT 1 周后，肺动脉内皮细胞即开始出现损伤、坏死和脱落。2、3 周后整个肺动脉血管发生纤维化、硬化，肺动脉血管管腔狭窄、血栓形成、堵塞，进而导致肺血管阻力增加、肺动脉压力升高。与此同时，炎症反应在MCT 诱发PAH 的过程中也扮演重要角色，病理学研究发现动物模型肺组织中有大量炎性细胞浸润。因此，在所有现存PAH 动物模型中，MCT 被认为最为接近CTD-PAH 发病机制的动物模型。然而，化学损伤不能完全等同于免疫损伤，故MCT 不能完全模拟CTD-PAH 的发生发展，而本实验的结果则显示用膜突蛋白免疫大鼠有望提供一个最为接近CTD-PAH的动物模型。

但作为先驱研究，本实验尚存不足。尽管设置了两种浓度的蛋白用于免疫，实际上得到的抗体浓度以及肺动脉压力却无显著差异。后续研究应增加浓度差，获得不同的抗体滴度，以确定抗体滴度与肺动脉压力之间是否存在相关性。此外，本实验动物数量有限，限制了实验结果的统计学效能，后续研究需增加实验动物数量。另外需解释的一点是，本实验的蛋白免疫组和阳性对照组的实验终点并不相同，这是基于免疫损伤不如药物化学损伤迅速的考虑。蛋白免疫的过程本身就耗时4 周，产生抗体后造成免疫损伤可能需要的时间更久，而经典的MCT方法实验终点最长21 d，大鼠可能不能存活到蛋白免疫组的实验终点，因此只能设定不同的终点。本实验选取6 周为实验终点，尽管肺动脉压力较空白对照已显著升高，但距阳性对照还有较大差距，考虑可能与免疫损伤程度较轻、发展缓慢有关，后续实验可延长实验终点。

综上所述，本实验首次利用膜突蛋白免疫大鼠，成功地使大鼠出现肺动脉高压，这是首个用免疫机制制造的肺动脉高压模型，一方面证实抗膜突蛋白抗体与肺动脉高压之间可能存在相关性，另一方面，也提供了一种最为接近CTD-PAH 发生机制的动物模型，为该疾病的诊治提供极大帮助。

［1］Simonneau G，Gatzoulis MA，Adatia I，et al.Updated clinical classification of pulmonary hypertension［J］.Am Coll Cardiol，2014，63(7):746.

［2］Condliffe R，Kiely DG，Peacock AJ，et al.Connective tissue disease-associated pulmonary arterial hypertension in the modern treatment era［J］.Am J Respir Crit Care Med，2009，179(2):151-157.

［3］王 迁，赵久良，李梦涛，等.抗膜突蛋白抗体与系统性硬化病相关肺间质病变的临床相关研究［J］.中华风湿病学杂志，2010，14(6):364-367.

［4］林剑国，石淑仙，刘云海，等.Moesin 分子及其特性［J］.国外医学分子.生物学分册，2001，23:4.

［5］Fievet B，Louvard D，Arpin，et al.M.ERM proteins in epithelial cell organization and functions［J］.Bioehim Biophys Acta，2007，1773:653-660.

［6］Negi VS，Tripathy NK，Misra R，et al.Antiendothelial cell antibodies in scleroderma correlate with severe digital ischemia and pulmonary arterial hypertension［J］.Rheumatol，1998，25(3):462-466.

［7］Li MT，Ai J，Tian Z，et al.Prevalence of anti-endothelial cell antibodies in patients with pulmonary arterial hypertension associated with connective tissue diseases［J］Chin Med Sci J，2010，25(1):27-31.

［8］尹 雷，李梦涛，田 庄，等.结缔组织病相关肺动脉高压康内皮细胞抗体检测及其靶抗原研究.［J］.中华风湿病学杂志，2010，14(5):297-300.

［9］Servettaz A，Guilpain P，Tamas N，et al.Natural anti-endothelial cell antibodies［J］.Autoimmun Rev，2008，7(6):426-430.

［10］Maarman G，Lecour S，Butrous G，et al.A comprehensive review:the evolution of animal models in pulmonary hypertension research;are we there yet?［J］.J Pulm Circ，2013，3 (4):739-756.