肝再生研究进展

冯仁鑫 邓星 张新 谢渭芬

第二军医大学附属长征医院消化内科(200003)

肝脏细胞主要由上皮细胞和间质细胞组成，前者包括肝细胞和胆管上皮细胞，后者包括肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)、肝血窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells，LSECs)、肝脏巨噬细胞(Kupffer cells)、肝脏自然杀伤细胞等。肝再生系指在急慢性肝损伤情况下，各种肝脏细胞为恢复正常肝脏体积和功能，在一系列细胞因子和化学因子的共同调控下进行的增殖、迁移和分化过程。肝细胞约占肝脏细胞总数的70%，是参与肝脏体积维持和功能发生的主要细胞。当各种病理原因导致肝细胞增殖能力明显受限时，肝脏内其他细胞或通过分泌细胞因子促进肝细胞增殖，或直接向肝细胞分化，参与肝脏再生过程。本文就不同肝脏细胞在肝再生过程中作用的研究进展作一综述。

一、正常肝脏的自我更新

肝细胞的前身是胚胎时期的肝母细胞，源自内胚层的肝母细胞首先表达肝脏相关标记物，随后逐渐向上皮转变，最后形成成熟肝细胞，维持肝脏的体积和功能。正常生理状态下，肝细胞更新相对较缓慢，平均生命周期为200～300 d，平均每2万个肝细胞中仅有一个处于有丝分裂期，肝脏每1～2年完整更新一次。目前对正常肝脏中更新肝细胞的来源尚存在争议，主要有两种不同观点。

首先是“流动肝脏”(streaming liver)假说。该假说认为在正常肝脏更新过程中，新生肝细胞产生于门静脉区，随后逐渐向中央静脉区迁移并不断成熟，在肝脏不同区域表达不同基因，发挥不同作用，最后在中央静脉区凋亡。但早年Bralet等［1］以LacZ基因标记大鼠肝细胞，并未发现正常肝脏更新过程中有肝细胞迁移现象。Thurman等［2］亦发现不同肝小叶内肝细胞代谢作用的不同与由肝脏血流方向决定的代谢物分布有关，与“流动肝脏”假说的观点相异。然而，近年又出现了支持“流动肝脏”假说的研究证据。Fellous等［3］和Furuyama等［4］分别在人和小鼠正常肝脏中发现，部分肝前体细胞(hepatic progenitor cells，HPCs)通过持续向肝细胞分化参与肝细胞更新，新生肝细胞于门静脉区产生，并向中央静脉区迁移，再次掀起了关于“流动肝脏”假说的争议。

其次是肝细胞自我复制理论。在“流动肝脏”假说受到质疑之际，Kennedy等［5］于1995年应用表达LacZ基因的转基因小鼠研究肝细胞增殖潜能，发现正常肝脏更新来源于肝细胞自我复制。近年Malato等［6］应用腺相关病毒载体介导由成熟肝细胞特异性蛋白Trt启动子驱动的Cre重组酶标记追踪R26R-EYFP小鼠的全部成熟肝细胞，发现注射病毒3～6个月后，肝细胞更新完成1/4～1/2，且未发现EYFP表达阴性的肝细胞，提示成熟肝细胞自我复制是肝细胞更新的惟一来源。但该研究中腺相关病毒作用持续时间较长(超过6个月)，期间所有成熟肝细胞均可因表达Trt而呈EYFP阳性，因此并不能解释肝细胞来源问题。

综合上述研究结果，似乎“流动肝脏”假说更为可信，但迄今仍缺乏充分的研究证据支持该假说，需开展更为严谨的细胞谱系追踪研究加以证实。

二、肝损伤后肝再生

肝脏最重要的特征之一是其在受损后能基本维持原有体积甚至功能的再生能力。与正常生理状态下的肝细胞更新相比，不同原因肝损伤后肝再生的背景有所不同，此时除肝细胞自身增殖外，可能还需要其他肝脏细胞、因子等共同参与，以维持肝脏生理功能。

1.肝细胞与肝再生:肝细胞约占肝脏细胞总数的70%和肝容量的80%，是维持肝脏功能和体积的主要细胞。肝脏由于位置和功能的特殊性而较易因毒素、病毒、免疫紊乱等因素受损，因此肝细胞具有与其他体细胞不同的生理特征。早在1965年，Bucher等就发现肝脏部分切除后，小鼠肝脏内细胞可快速进入增殖状态，且增殖细胞比例在一定范围内与切除肝脏体积呈正相关;其后的肝细胞连续移植实验证实部分肝细胞具有几近无限的增殖能力［7］。近年研究中，Malato 等［6］、Español-Suñer等［8］发现在肝大部切除和 CCl4所致急性肝损伤中，超过98%的肝细胞来源于残存肝细胞的自我复制，在胆碱缺乏、乙硫氨基酪酸饮食补充(CDE)所致慢性肝损伤中，残存肝细胞自我复制产生的肝细胞亦高达97%，而在 CCl4和 3，5-二乙酯基-1，4-二氢三甲基吡啶(DDC)所致慢性肝损伤中甚至未发现其他细胞来源的新生肝细胞。Schaub等［9］对CDE慢性肝损伤小鼠模型肝脏中的不同细胞进行标记追综，同样发现残存肝细胞是再生肝细胞的惟一来源。上述研究表明，在各种急慢性肝损伤中，残存健康成熟肝细胞持续分裂仍然是最快速、最有效的肝再生方式。

肝大部切除后，大鼠门静脉区肝细胞除自我复制外，还可分泌大量血管内皮生长因子(VEGF)，通过诱导LSECs增殖促进肝再生［10］。慢性肝损伤时，受损成熟肝细胞可产生Hedgehog配体，激活HPCs内Hedgehog通路，促进其增殖并部分向肝细胞分化［11］。

2.HPCs与肝再生:HPCs系指肝脏中可向肝细胞和胆管上皮细胞分化的一类细胞，通常位于胆管末端的Hering管。肝细胞增殖能力明显受限和(或)肝细胞需求明显增加时，HPCs可活化、增殖并向肝细胞分化，这一过程称为“胆管反应”(ductular reaction)或“卵圆细胞反应”(oval cell reaction)。研究发现上皮细胞黏附分子(EpCAM)、Sox-9、骨桥蛋白(OPN)、OV-6、CK-19、panCK、CD133、CD34、Scal-1 等标记阳性的细胞具有HPCs的生物学特性。对HPCs的研究历史虽较长，但其在肝损伤后肝细胞再生中的作用一直存在争议。

①HPCs对急性肝损伤的作用:Katoonizadeh等［12］对急性或亚急性重度肝损伤患者的研究显示，当肝细胞缺失超过50%，出现急性甚至爆发性肝衰竭时，HPCs数量明显增加;在同一肝脏中，与组织残存较好的区域相比，全小叶或多小叶坏死的区域有更多HPCs以及由其分化而来的中间状态肝细胞(intermediate hepatocytes)。上述发现提示HPCs参与急性肝损伤时的肝再生，参与程度与肝细胞缺失率和临床肝损伤严重程度呈正相关。

动物实验中，Malato等［6］发现小鼠肝大部切除后3周，约1.4%的新生肝细胞并非源自残存肝细胞，提示HPCs参与了小部分肝细胞再生;但 Español-Suñer等［8］在肝大部切除和CCl4所致小鼠急性肝损伤中几乎未见HPCs来源的新生肝细胞。鉴于HPCs的来源和标记物的多样性，且其是否参与肝再生可能与肝损伤严重程度相关，故不能排除HPCs参与急性肝损伤后肝细胞再生的可能性。

②HPCs对慢性肝损伤的作用:研究表明酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、慢性病毒性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝病等晚期肝病患者多有肝细胞衰老、坏死和(或)细胞周期阻滞，此时卵圆细胞可活化并参与肝再生，卵圆细胞数量及其向肝细胞样细胞分化的程度与肝细胞损伤和炎症程度呈正相关［13-15］。Lin等［16］将线粒体 DNA 突变［细胞色素c氧化酶(CCO)缺失］作为克隆扩增标志检测了10例肝硬化患者的526个肝再生结节，发现CCO缺失结节的线粒体DNA突变类型与周围HPCs相同，表明再生结节来源于HPCs，间接证实HPCs参与肝细胞再生。Yoon等［17］在慢性病毒性肝炎肝纤维化患者的肝组织中发现，胆管反应细胞及其周围部分肝细胞同时表达CK-19和EpCAM，而周围其他肝细胞仅表达EpCAM，这类仅表达EpCAM的肝细胞随病程进展不断增多，至肝硬化阶段可占肝细胞的50%;从胆管反应细胞、EpCAM阳性肝细胞至EpCAM阴性成熟肝细胞，端粒长度逐渐缩短。上述发现表明EpCAM阳性肝细胞来源于胆管反应细胞，为慢性肝损伤时再生肝细胞的HPCs来源提供了直接证据。

动物实验亦显示，在 CCl4、DDC、CDE、胆管结扎(DBL)、2-乙酰氨基芴/肝大部切除(2-AAF/PHx)等所致慢性肝损伤中，位于肝胆管末端和门静脉区的HPCs可增殖并部分向肝细胞分化［4，8，18］。不同类型肝损伤中的 HPCs活化程度及其向肝细胞分化的程度不尽相同。Furuyama等［4］发现源自Sox-9阳性HPCs的肝细胞在CCl4和DBL小鼠模型中增多，在其他肝损伤模型如肝大部切除、DDC模型中则相对较少，而 Español-Suñer等［8］在 CDE 小鼠模型中发现仅 2.45% 的新生肝细胞来源于OPN阳性HPCs，Schaub等［9］则未在CDE小鼠模型中发现CK-19阳性HPCs向肝细胞分化。上述动物实验即使发现源自HPCs的肝细胞，其在新生肝细胞中所占比例亦小于5%，与在人类肝脏中观察到的现象有很大差异，究其原因可能为动物模型肝损伤较轻且病程较短，而肝病患者肝损伤较重且病程较长。更明显的胆管反应现象可能需在损伤更重、病程更长的动物模型中加以证实。

有较多研究关注了HPCs参与肝再生的机制。Pi等［18］发现结缔组织生长因子(CTGF)表达上调可能在卵圆细胞反应和增殖中起关键作用。此外，HPCs的活化、增殖尚与白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)家族成员TWEAK等相关［19-20］，而 Hedgehog、Wnt、Notch 通路则在调控 HPCs分化方向中发挥重要作用［21-23］。

值得注意的是，新近Kuramitsu等［24］发现在肝大部切除小鼠模型中，HPCs活化可加速CCl4诱导的纤维化进程而不利于肝细胞再生。该研究显示，HPCs活化可增强模型小鼠的转化生长因子-β1(TGF-β1)、前胶原 α1、α 平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)等基因表达，早期抑制肝细胞增殖，晚期加速肝细胞凋亡。

3.HSCs与肝再生:HSCs是位于Disse间隙的一类间质细胞，约占肝脏细胞总数的13%。目前普遍认为HSCs活化是肝纤维化发生、发展的中心环节，近年大量研究发现HSCs在损伤肝脏的再生过程中亦起重要作用。

HSCs在解剖结构上与肝细胞直接接触，具有感知其损伤而调控肝再生的可能性。有研究显示肝损伤时活化的HSCs在卵圆细胞周围大量聚集，以左旋半胱氨酸抑制HSCs活化或以胶霉毒素清除活化的HSCs，卵圆细胞反应和肝细胞增殖能力明显减弱，肝细胞凋亡和坏死增加［25-26］，提示HSCs活化可直接或间接调控肝细胞再生，其机制可能与HSCs分泌肝细胞生长因子(HGF)以促进HPCs和肝细胞内的c-Met表达有关［27-28］。此外，HSCs还可分泌成纤维细胞生长因子7(FGF7)，与肝细胞内受体FGFR2b结合以促进其增殖［29］。Chen 等［30］的研究发现，HSCs在 2-AAF/PHx所致慢性肝损伤早期主要分泌HGF以促进HPCs增殖，晚期则主要分泌TGF-β1以抑制HPCs增殖，在卵圆细胞反应介导的肝再生中发挥重要调控作用。

另有研究发现HSCs本身即具有HPCs的特性。静息HSCs(Q-HSCs)可同时表达三个胚层以及部分干细胞标记物，在不同培养条件下可分别向肌成纤维细胞、内皮细胞样细胞、肝细胞样细胞等分化，提示HSCs可能作为HPCs之一参与肝再生。由于Q-HSCs表达胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)，Yang等［31］在CDE小鼠模型中以GFAP驱动的Cre重组酶/绿色荧光蛋白(GFP)标记追踪Q-HSCs，发现其可活化并向肝细胞分化，参与约1/3的肝细胞再生。Swiderska-Syn等［32］在肝大部切除小鼠模型中发现，高达25%的新生肝细胞来源于活化HSCs，Michelotti等［33］在慢性肝损伤模型中亦有类似发现，其机制可能与HSCs内Hedgehog通路激活介导的间质-上皮转化有关。然而上述研究采用的HSCs标记物缺乏特异性，如GFAP驱动的Cre重组酶还可标记胆管上皮细胞，必须排除胆管上皮细胞参与这一过程的可能性。Mederacke等［34］应用更为特异性表达于HSCs的卵磷脂视黄醇酰基转移酶(Lrat)驱动的Cre重组酶标记追踪小鼠HSCs，排除了HSCs在损伤肝脏中兼具HPCs功能的可能性。对于此结果，应考虑到动物模型中的肝细胞损伤程度不足以刺激HSCs向肝细胞分化等问题。在2-AAF或倒千里光碱/PHx这一更为严重的肝损伤模型中，Kordes等［35］予模型大鼠尾静脉移植异体原代HSCs，细胞标记追踪显示部分移植细胞可向HPCs转化，继而向成熟肝细胞分化，参与肝细胞再生。然而目前尚未见应用此模型对自体HSCs进行追踪的研究证据。

此外，HSCs还可通过分泌基质金属蛋白酶(MMPs)、TIMPs参与细胞外基质的重塑，为慢性肝损伤时HPCs的活化、增殖、存活提供适宜的微环境并影响其分化方向［36］。

4.LSECs与肝再生:LSECs是肝脏间质中数量最多的细胞，约占肝间质细胞总数的70%。其沿肝窦伸展并呈线性排列，是一类形态和功能相对独特的内皮细胞。早在1993年，即有研究者在CCl4所致急性肝损伤中发现LSECs可分泌大量HGF。其后Greene等［37］在肝大部切除小鼠模型中发现，腹腔注射血管生成刺激因子bFGF在促进LSECs增殖的同时，可使肝脏质量明显增加，提示LSECs可能在肝再生中起重要作用。近年Ding等［38］在小鼠模型中证实，肝大部切除后3 d内，LSECs主要通过VEGF/VEGFR2通路上调内皮细胞特异性转录因子Id1，以旁分泌方式分泌HGF、Wnt2，作用于肝细胞促进其增殖;肝大部切除4 d后，LSECs在该通路作用下大量增殖，为大量新生肝细胞提供血液供应，参与后期肝再生。然而，亦有研究［39］报道肝脏成熟LSECs及其前体细胞的HGF表达量和增殖率相对较低，骨髓来源的LSECs前体细胞是肝大部切除后早期内皮细胞源性HGF和后期大量LSECs的主要来源。鉴于上述研究结果均基于残存肝脏组织结构未受影响的肝再生情况，而其他肝损伤动物模型和人类肝脏疾病多伴有肝脏组织结构破坏以及LSECs周围微环境改变，LSECs在肝再生中的作用是否依然存在及其作用程度尚需进一步研究。

5.其他肝脏细胞与肝再生:越来越多的研究表明，Kupffer细胞等其他肝脏细胞在肝再生中的作用不容忽视。肝再生过程中，Kupffer细胞通过吞噬肝细胞碎片诱导Wnt3a表达，可由此激活毗邻HPCs中的Wnt-β-catenin-CTNNB1通路，从而促进HPCs向肝细胞分化［23］。Kupffer细胞还可分泌TWEAK，通过与卵圆细胞内受体Fn14结合，促进卵圆细胞增殖［20］。此外，Kupffer细胞尚可分泌 IL-6、TNF-α 等以促进 HSCs活化［40］。另有研究［41］显示 Kupffer细胞主要通过促进HPCs向肝实质迁移而促进肝再生，对HPCs增殖的影响不明显。脐带、骨髓、脂肪组织来源的间质干细胞或可直接分化为与肝细胞功能相近的细胞［42-43］，或可分泌细胞因子促进肝细胞存活、增殖并减少其凋亡［44-45］。而肝脏自然杀伤细胞可通过分泌干扰素γ(IFN-γ)对肝细胞增殖起抑制作用［46］。

三、结语与展望

综上所述，肝脏再生是一系列细胞和细胞因子共同参与并相互调控的复杂过程。肝细胞以其强大的自我复制能力在各种生理和病理情况下的肝再生过程中发挥主导和关键作用，肝脏内的其他细胞如HSCs、LSECs、Kupffer细胞等可通过分泌细胞因子等方式促进这一过程。HPCs和HSCs还可能作为肝细胞来源之一参与肝再生。由于人类慢性肝病尤其是在终末期系以肝细胞大量破坏和功能丧失为主要表现，促进肝细胞再生仍是目前慢性肝病治疗面临的主要问题。深入研究肝再生过程中肝脏内不同细胞的作用及其机制，明确慢性肝损伤状态下新生肝细胞的来源，有助于进一步增加对肝脏再生的了解，为各种晚期肝病的临床诊治提供新的思路和方法。

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