丹龙醒脑方抗缺血性脑损伤机制的实验研究进展

曹泽标，周小青*，张利美，陈娉婷，刘旺华

（1.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学中医诊断研究所，湖南 长沙 410007）

丹龙醒脑方抗缺血性脑损伤机制的实验研究进展

曹泽标1，周小青2*，张利美1，陈娉婷1，刘旺华2

（1.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学中医诊断研究所，湖南 长沙 410007）

丹龙醒脑方；缺血性脑损伤；机制；级联反应；神经再生

脑血管病是威胁中老年人健康的常见疾病，据卫计委《2014中国卫生和计划生育统计年鉴》显示，在2013年居民主要疾病发病率、死亡率和致残率中，脑血管病都排前三位，给社会和家庭带来了巨大负担，而脑血管病中约80%属缺血性[1]。研究表明，脑缺血后，将发生缺血性脑损伤级联反应[2]，使神经细胞大量丢失导致脑功能缺失；同时处于“静息”状态下的神经干细胞被激活而发生神经再生[3]。因此，干预级联反应减少脑缺血后神经细胞丢失和促进神经再生已成为治疗缺血性脑血管病的主要途径。

丹龙醒脑方是周小青教授经验方，用于治疗缺血性脑血管病，现已作为附属医院院内制剂，并获得了中药新药临床研究批文（批件号：2003L1997）。十多年来，在临床应用该复方取得良好疗效的同时，研究人员结合现代科技，对其抗缺血性脑损伤的机制进行了大量实验研究，发现其能针对脑缺血后的病理生理过程进行多方位、多环节、多靶点干预，现将有关研究成果和进展综述如下。

1 丹龙醒脑方与缺血性脑损伤级联反应

1.1 缺血性脑损伤级联反应

缺血性脑损伤是一个复杂的病理生理过程，它包括缺血期的原发性损伤和再灌注期的继发性损伤，二者紧密联系，呈现出级联反应。概括地说，该级联反应主要涉及代谢紊乱、炎症反应、循环障碍和细胞凋亡等环节。

1.1.1 代谢紊乱 该级联反应的始动因素是缺血缺氧，导致ATP合成减少，离子泵部分功能失效和细胞膜去极化，细胞间隙中以谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)为代表的兴奋性氨基酸（EAAs）浓度升高，呈现出一定的毒性；同时Ca2+大量进入胞内出现钙超载，线粒体功能障碍并损伤，一氧化氮（NO）等自由基及其代谢产物如丙二醛(MDA)生成增多、自由基生成抑制剂如超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，从而表现出一定的氧化损伤[4]。

1.1.2 炎症反应 氧自由基及其他信使可激活核转录因子尤其是核因子κB亚基(NF-κB)调控的炎症相关基因的表达[5]，导致炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）等表达增多，同时趋化因子释放，黏附分子如细胞间黏附分子1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子l等表达上调，白细胞黏附于血管内皮细胞阻塞微血管，形成“无复流现象”，并释放大量炎性介质和细胞因子，吸引更多中性粒细胞浸润，加重炎症，造成恶性循环。

1.1.3 循环障碍 自由基和钙超载可进一步导致血液流变学改变，如脑血管痉挛、红细胞变形性差、血小板聚集、纤维蛋白含量增加、血液黏稠度增加等，致使脑微小血管血栓形成；另外，NO等自由基的扩血管作用及炎性反应可使血脑屏障（BBB）通透性增加，甚至破坏BBB[6]。

1.1.4 细胞凋亡 脑缺血后EAAs毒性、钙超载等各种诱导因素可引起细胞凋亡启动，然后主要通过死亡受体通路和线粒体通路介导细胞凋亡，表现为前者重要因子Fas/FasL、TNF-α、Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）、凋亡蛋白酶（caspase）-8、caspase-3等表达上调；后者的重要因子细胞色素-C（Cyto-C）、第二种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活物（Samc）、caspase-9、caspase-3等表达上调[7]，凋亡抑制蛋白（IAPs）尤其是X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）表达下调。细胞凋亡受基因调控，脑缺血后，促凋亡基因（如Bax）及抑制凋亡基因（如Bcl-2）表达会发生动态变化[8]，影响神经细胞凋亡。需要指出的是，上述各环节常密切相关，互为因果，彼此重叠，形成恶性循环，最终导致脑细胞死亡和脑功能缺失。

1.2 丹龙醒脑方可多环节干预缺血性脑损伤级联反应

1.2.1 调节脑组织代谢 研究发现，丹龙醒脑方抗缺血性脑损伤机制与其调节脑组织代谢有关。研究者用双侧颈总动脉反复夹闭再灌注同时腹腔注射硝普钠建立VD大鼠模型，研究该方对脑组织代谢的影响。结果显示丹龙醒脑片组能使Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性明显升高，脑组织中Glu、Asp、MDA、Ca2+的含量明显降低，SOD活性显著升高。表明该方能改善脑组织能量代谢障碍，维持细胞的主动转运功能，使细胞内外离子浓度趋向正常[9]；能调节脑组织EAAs含量、减轻其兴奋性毒性，保护大脑神经细胞[10]；还可以改善自由基代谢、减轻神经细胞Ca2+超载[11]。另外，对脑缺血再灌注沙土鼠模型，丹龙醒脑片也能调节其脑组织EAAs含量、减轻其兴奋性毒性，保护大脑海马区神经元[12]。

1.2.2 抑制脑内炎症 多项实验表明丹龙醒脑方可通过抑制炎症来发挥抗缺血性脑损伤的作用。在观察活血通络法（丹龙醒脑方）对大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)再通诱导的中性粒白细胞浸润的影响时，发现丹龙醒脑方能降低脑组织髓过氧化物酶（MPO）活性，减轻再灌注脑组织中性粒白细胞的浸润[13]。研究组成员还分别就丹龙醒脑方对老龄大鼠脑缺血再灌注模型的NF-κB及相关炎症因子的表达进行了探讨[14-16]，显示该方能显著抑制NF-κB及ICAM-1、TNF-α、IL-1β、IL-6的表达，表明丹龙醒脑片抗老年脑缺血再灌注损伤的保护机制与其抑制由缺血再灌注损伤诱导的NF-κB及相关炎症因子的表达有关。

1.2.3 改善大脑血液循环 研究人员观察了丹龙醒脑片对VD模型大鼠血液流变学的改善作用，发现丹龙醒脑片组全血黏度、血浆黏度、红细胞压积及纤维蛋白原浓度均降低，提示丹龙醒脑片能通过改善脑缺血损伤后大鼠血液流变状态，从而改善大脑血液供应[17]。对实验性脑血栓形成大鼠保护作用及对花生四烯酸(AA)代谢的影响研究表明，丹龙醒脑片组脑组织伊文思兰吸光度值A620、血浆血栓素B2（TXB2）、6-酮前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)含量均明显降低，显示丹龙醒脑片对血栓诱导剂诱导的脑血栓形成具有抑制作用，对脑血栓形成后脑血管通透性的升高有抑制作用，其作用可能是通过对抗脑血栓形成而发挥的[18]。

1.2.4 减少神经细胞凋亡 大量研究证实丹龙醒脑方抗缺血性脑损伤的一个非常重要的机制是减少神经细胞的凋亡。研究显示丹龙醒脑片能使MCAO大鼠模型神经细胞凋亡指数（AI）和凋亡神经细胞积分光密度（IOD）明显降低，海马区存活细胞数明显增多[19]，表明该方能减少神经细胞凋亡。研究者还从介导细胞凋亡的两条主要信号通路进行了探讨，发现该方能显著抑制Fas/FasL、TNF-α的表达，使FADD、caspase-8、caspase-3阳性细胞数明显减少，表明该组方的作用机制可能与抑制细胞凋亡死亡受体通路有关[20-21]。对于线粒体通路，该方能显著减少Cyto-C、caspase-9、caspase-3、Smac并促进XIAP的表达，保护神经元及神经功能，提示该方作用机理与抑制细胞凋亡线粒体通路有关[22]。另外，研究人员还从细胞凋亡基因调控层面进行了研究，发现丹龙醒脑方组抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达显著性增加，凋亡基因Bax蛋白表达降低，表明丹龙醒脑方能通过增强Bcl-2的表达、抑制Bax的表达来抑制神经元凋亡，起到保护神经元的作用[23]。

2 丹龙醒脑方与缺血性脑损伤后神经再生

2.1 缺血性脑损伤后神经再生

缺血性脑损伤后的神经再生主要是指神经干细胞（NSCs）的增殖、迁移和分化过程。神经干细胞终身具有分裂潜能和自我更新能力，广泛存在于神经系统[24]。研究显示，在脑组织发生缺血缺氧等损伤后，NSCs能通过不对称分裂增殖分化成神经元和胶质细胞，同时向梗死区迁移，参与神经功能的修复过程，即神经发生。在此过程中，神经干细胞所表达的特异性标志物巢蛋白（Nestin）及星形胶质细胞特异性活化的标志蛋白胶质纤维酸性蛋白 （GFAP）等表达升高[25]。同时，神经再生还受多种调节因子和信号通路的调控。研究表明，损伤后多种促进神经再生的生长因子如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），细胞因子如睫状神经营养因子（CNF）及营养因子如胶质源性神经营养因子（GDNF）、神经生长因子（NGF）的表达增加[26]，这些神经再生的调节因子在NSCs增殖、分化中发挥重要作用。同时，与神经干细胞增殖分化相关的信号通路如Wnt/β-catenin[27]、Notch、骨形成蛋白、促分裂素原活化蛋白激酶、NF-κB信号通路等启动，从各个环节对NSCs的增殖、迁移和分化进行调控。同样，各调节因子和信号通路并非孤立的，而是交叉重叠，相互影响，共同构成了一个影响神经再生的精密网络调控系统。

2.2 丹龙醒脑方能促进缺血性脑损伤后神经再生

2.2.1 促进NSCs的增殖和分化 研究者以5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入法检测NSCs增殖，显示丹龙醒脑方组NSCs增殖数量显著升高，表明该方能促进NSCs的增殖[28]。同时，研究人员还通过免疫组化法检测Nestin，间接探讨该方促NSCs增殖作用，同样用免疫组化法检测GFAP来探讨其促NSCs分化作用，发现丹龙醒脑方组在治疗3 d和7 d后Nestin的平均光密度增加，GFAP的平均灰度值减少，提示该方能促进NSCs增殖和分化，其抗脑缺血损伤的机制可能与促进海马区神经细胞增殖和分化有关[29]。

2.2.2 促进多种促神经再生调节因子的表达 研究人员通过探讨丹龙醒脑方对大鼠脑缺血再灌注后NGF、bFGF和GDNF表达的影响，发现较之模型组，丹龙醒脑方中、大剂量组NGF、bFGF、GDNF的阳性表达灰度值均显著降低，即阳性率增大，提示丹龙醒脑方可能通过促进NGF、bFGF、GDNF的表达来促进NSCs增殖[28]。

2.2.3 通过调控相关信号通路促进神经再生 脑缺血后神经再生受多条信号通路的调控，有研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在NSCs的增殖分化中起重要作用，甚至处于核心地位[30]。本研究组也从Wnt/β-catenin通路探讨了丹龙醒脑方促进MCAO大鼠神经再生的机理。近期研究发现，与模型组比较，西药组、丹龙醒脑方组BrdU阳性细胞数、βcatenin、Wnt-3a蛋白及mRNA表达明显增强，差异有统计学意义，表明丹龙醒脑方可能通过激活βcatenin及Wnt-3a蛋白表达促进神经干细胞增殖[31]，即与调节Wnt/β-catenin通路活化有关。

3 结语

丹龙醒脑方由丹参、三七、地龙、石菖蒲、远志、菟丝子、淫羊藿等组成，具有活血通络、化痰开窍、补肾生髓之功。大量研究显示[32-33]，对于缺血性脑损伤，活血通络和化痰开窍法能干预级联反应，补肾生髓法能促进神经干细胞的增殖分化。另外，现代药理研究也表明，丹参酮ⅡA能降低脑水肿，清除自由基，抑制炎症[34]，减少神经细胞凋亡[35]；三七总皂苷能降低脑部细胞因子的表达和血脑屏障通透性[36]；香港远志黄酮苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠BBB有保护作用[37]；淫羊藿及其提取物对NSCs具有直接促增殖作用[38]。这些都可能是丹龙醒脑方多环节干预级联反应和促进神经再生的物质基础，值得进一步研究。

然而，在取得大量实验研究成果的同时，还有一些尚待完善之处：（1）在多环节干预级联反应方面已经积累了较多成果，但对促进神经再生方面研究较少，而且不够系统、深入，尤其是对可能的信号通路的研究，尚未见报道；（2）丹龙醒脑方干预级联反应机制及促进神经再生机制分别在抗缺血性脑损伤中的作用时间窗及二者间相互关系有待研究；（3）对级联反应中各环节其他靶点的干预、对不利于神经再生相关调节因子的作用及对与神经再生相关的其他信号通路的影响尚待研究；（4）除对方中主要成分三七总皂苷进行了抗缺血性脑损伤部分研究外，尚缺乏从本方药理学角度探讨其抗缺血性脑损伤的机制，显然不利于该方科学性的解释和新药的开发；（5）目前研究多局限在动物实验，尚未见细胞水平的研究报道。面对这些问题，研究组正在对其中一部分进行探讨，而且已经取得了一定成果；对某些尚未着手研究的部分，期待将来条件成熟时逐渐解决。

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（本文编辑 匡静之）

Experimental Research Progress on the M echanism of Danlongxingnao Fang against Ischem ic Brain Injury

CAO Zebiao1,ZHOU Xiaoqing2*,ZHANG Limei1,CHEN Pingting1,LIU Wanghua2

（1.Graduate School,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China; 2.Research Institute for Diagnostics of TCM,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China）

Danlongxingnao Fang;ischemic brain damage;mechanism;cascade reaction;nerve regeneration

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.019

2014－12－24

国家自然科学基金资助项目（81373702，81473567）。

曹泽标，男，在读硕士研究生，研究方向：中医心脑血管疾病证治。

*周小青，男，博士，教授，博士研究生导师，E-mail：zxq5381@sohu.com。