人羊膜间充质干细胞的临床前研究进展＊

张递思综述，史明霞△，董 坚审校

（昆明医科大学第一附属医院：1.血液科；2.肿瘤内科，昆明650032）

羊膜位于胎盘的最内层，主要由来源于外胚层的上皮细胞和来源于中胚层的间充质细胞构成。其不含血管，细胞成分相对简单，在胎儿娩出后即成为“废弃物”。人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）有着来源丰富、无需有创操作、取材几乎不受限制、分离培养方法简便、有向3个胚层来源的组织细胞分化的潜能、免疫原性低等多种优点，可能成为一种更加理想的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）临床研究及应用的来源［1］。

1 hAMSCs的生物学特性

1.1 免疫表型及基因表达 目前，hAMSCs还没有统一的表面标志物，但是大多数表面抗原和骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）相似。Kim 等［2］通过分离羊膜间充质细胞并在体外扩增至第2、3代后获得成纤维样细胞，通过不同的培养条件分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经元细胞。免疫表型分析结果显示，其表达SSEA-3、SSEA-4、胶原 蛋白-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ、-Ⅳ、-Ⅻ、纤维连接蛋白、α-SMA、波形蛋白（Vimenti）、结蛋白、细胞角蛋18（CK18）、HCAM-1、成纤维细胞表面蛋白和人类白细胞抗原（HLA）-ABC；弱表达ICAM-1 蛋白；不表达TRA-1-60、VCAM-1、vWF、PECAM-1和HLA-DR。用反转录聚合酶链反应（RTPCR）方法检测发现无论传至几代，一些基因［如：Oct-4、Rex-1、SCF、神经细胞黏附分子（nerve cellular adhesion mo1ecul，NCAM）、巢蛋白（Nestin）、骨形态发生蛋白（bone morphogeneticprotein，BMP）4、心肌特异性转录因子GATA-4、肝细胞核因子（hepatocyte neclear factor，HNF）-4α、波形蛋白（Vimenti）、CK18］始终持续表达。而一些基因（如：鼠短尾突变体表型、FGF-5、Pax-6和BMP2）不表达。其中，研究发现，α-甲胎蛋白、HLA-ABC、HLA-DR基因表达于早期（2～3代）的细胞中而不表达于晚期（7～13代）的细胞中，且在第3代以上的细胞中可检测出端粒酶活性。近年来，流式细胞仪分选干细胞侧群技术广泛应用于提取多分化潜能干细胞。朴正福等［3］利用流式细胞分选技术hAMSCs中分离提纯干细胞（hAMC-SP细胞），通过FACS分析结果示，此细胞表达Nestin、Vimentin、整合素家族成员（CD49b、CD49c、CD49d、CD49e）、CD9、CDl3、CDl9、CD29、CD44、CD46、CD51、CD59、CDl66及干细胞相关的Oct-3／4 抗原。HLA-ABC、TRA-1-81 及SSEA-4为弱表达；CD34、CD45、CDll7、CD56、CD90、CDl05、CDl06、CDl33、Fit1、Musashil及HLA-DR无阳性结果，TRA-1-60及SSEA-3也表达阴性。实验结果提示此细胞与其他间充质干细胞一样，不表达造血干细胞标记，表达整合素分子成员及间充质干细胞特征性表面标志蛋白。

1.2 增殖能力、免疫原性及致瘤性 SSEA-3、SSEA-4是胚胎干细胞和胚胎生殖细胞的表面标志特征，成体干细胞包括BMMSCs无表达。研究发现羊膜间充质细胞表达SSEA-3、SSEA-4，说明AM-MSCs可能是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的一个中间等级的干细胞，因此，其增殖能力比BMMSCs更强。同时发现传至（14.5±0.9）代、培养（146.8±8.9）d后、群体培增平均数（36.9±4.7）后细胞衰老［2］。

人羊膜细胞的低免疫原性和人羊膜组织移植不易引起免疫排斥反应。有学者通过实验发现将AM-MSCs与人外周血单个核细胞（PBMC）或纯化的T 细胞直接transwell共培养都可以抑制同种异体混合淋巴细胞反应诱导的淋巴细胞增殖，随着AM-MSCs细胞的增多，其抑制效应越明显，当细胞比例达到l∶l时，抑制效应最强。近来有学者进一步研究表明hAMSCs通过分泌可溶性因子在抑制淋巴细胞增殖中起作用，其中前列腺素可能是关键的效应分子。并且首次证实了hAMSCs抑制淋巴细胞增殖的能力是其本身所具有的，而不是像BMMSCs抑制淋巴细胞增殖需要活化刺激等条件［4-5］。近来研究报道，采用原代或第1～3代的间充质干细胞进行治疗，不会有致瘤的危险。而目前对于hAMSCs的致瘤性问题，国内外的研究均较少。朴正福等［3］通过在体外进行癌化实验，提示hAMSCs传代培养时保持细胞原有的特性，不具有致瘤性。利用体外细胞集落分析方法对hAMSCs的致瘤性进行了简单的研究，发现AMC-SP 细胞未形成集落，而作为阳性对照的HepG2形成了多数较大集落。

2 hAMSCs的临床前研究

干细胞是具有自我更新、高度增殖和多系分化能力的细胞群体，是替代、修复或加强受损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞，是组织工程再生医学领域的重要生物材料来源。hAMSCs能分化为多种细胞，且因其自身的诸多优势，使其在再生医学应用中具有很高的应用价值。近年来已有不少学者对其做了许多临床前的探索研究。

有研究证实羊膜间充质干细胞可促进人脐血单个核细胞和CD34＋细胞扩增，扩增后两者在甲基纤维素半固体培养基中能够形成造血祖细胞集落，其造血支持作用与BM-MSCs相似，二者比较差异无统计学意义［6］。最近有学者首次使用hAMSCs移植治疗大剂量顺铂诱导的骨髓抑制，发现hAMSCs移植治疗较早地改善顺铂所致骨髓抑制小鼠的造血功能［7］。

Kim 等［8］发现hAMSCs较脂肪来源的间充质干细胞表达更高水平的血管内皮生长因子-A、血管生成素-1、肝细胞生长因子、纤维母细胞生长因子-2（FGF-2），特别是抗凋亡因子（Akt-1）也在hAMSCs中高表达。进一步研究发现，当移植hAMSCs入小鼠缺血性后肢中，观察到其自发的形成血管样结构以及表达特定的内皮基因和蛋白。移植hAMSCs后增强血液灌注及毛细血管密度，表明hAMSCs能增加新血管形成，且实验证实其移植率高。以上说明移植hAMSCs在治疗缺血性下肢中可能具有可观的疗效。Warrier 等［9］采用实时荧光PCR（RT-PCR）、免疫组织化学法等方法显示羊膜来源的间充质干细胞在体外有生成内皮和血管的能力。进一步研究证实其本身表达促血管生成因子（如：Tie2、Ang1、VEGF、VEGFR、vWF、KDR 和Flt4）。这表明可将其应用于创伤愈合、中风、缺血性疾病和组织修复中。Kim 等［10］和Fatimah等［11］采用糖尿病的NOD／SCID 小鼠模型，也证实了羊膜间充质干细胞通过分泌血管新生因子和增强移植分化能力，促进伤口愈合。最近有学者发现连续传代培养后羊膜间充质干细胞对血管生成素-1的表达增强。因胎儿的创伤愈合需要最小的炎性反应和有限的疤痕，Klein等采用胎羊羔模型发现，虽hAMSCs不是创伤愈合过程中绝对必需的，但其能加快创伤闭合，增加伤口处的细胞外基质。而对其中转化的影响还需进一步研究。

近来有研究发现hAMSCs在体外经自然生物诱导剂RPE（老鼠再生胰腺提取物）诱导可分化为分泌胰岛素的细胞［12］。也有学者通过实验观察到羊膜间充质干细胞能形成胰岛样细胞团（ILC），采用免疫组织化学法显示已分化的ILC 可表达人胰岛素、胰高血糖素、生长抑素。而实时定量PCR 显示除表达人胰岛素、胰高血糖素、生长抑素，还表达Ngn3、Isl1。将其移植入实验性糖尿病小鼠，可使小鼠恢复正常的血糖且没有免疫排斥［13］。以上说明羊膜间充质干细胞具有形成新生胰岛的能力，使其可能用于细胞替代治疗糖尿病。

hAMSCs也能分化为神经元细胞。有研究证实将经BHA诱导的hAMSCs移植入小鼠局灶缺血模型（此模型有不同程度的左侧偏瘫伴随右侧霍纳氏综合征），分别于1、3、6、8周后检查，发现与对照组比较，移植组小鼠的神经系统症状有明显的改善。且移植入小鼠体内的hAMSCs主要集中于移植部位及其周边区域，而在某些特定的情况下，其向缺血部位迁移。未检测到缺血部位的胶质增生及淋巴细胞浸润。以上实验说明，用BHA 诱导过的hAMSCs能分化为表达NSE 的神经元样细胞。此外，hAMSCs移植可能改善局灶性脑缺血后造成的神经系统症状［14-15］。近来以大鼠为模型研究发现hAMSCs能显著改善脑缺血大鼠的行为障碍、减少脑梗死体积及提高功能恢复。将hAMSCs移植入阿尔茨海默病老鼠中，发现其通过免疫调节及旁分泌机制持久地改善了老鼠的记忆功能［16］。Paracchini等研究发现羊膜间充质干细胞有可能分化为与囊胞性纤维症（CF）发病相关的器官（肝与肺）的上皮细胞，并能有助于部分修复CF的表型。有研究表明，hAMSCs能分化为心肌细胞，且能高效率地重组成为诱导性多能干细胞（MiPSCs），由MiPSCs分化得来的心肌细胞表达c-kit细胞的表面标志，其能纯化心肌细胞群且能用于同种异体的心脏干细胞疗法［17-18］。最近研究发现三维培养系统能增加hAMSCs分化为心肌样细胞，使其能更有效地应用于再生医学［19］。还有学者通过将羊膜间充质干细胞直接移植入心肌梗死的NOD／SCID小鼠模型中的缺血心肌组织的周边，发现羊膜间充质干细胞能显著表达相关的趋化因子及其受体，并改善了心脏功能，这一试验表明了将羊膜间充质干细胞应用于缺血性心血管病的治疗的可能性［20］。

有学者建立有气管缺陷的胎儿羊羔模型，发现移植羊膜间充质干细胞能增加其气管的修复，表明了将来应用于围产期儿气道修复的可能性［21］。在博来霉素诱发的肺损伤活体模型中研究中发现，hAMSC能减轻肺纤维化、炎性反应，以及恢复肺的通气功能。

近来有学者用载有hAMSCs的羊膜直接移植到有皮肤伤口的小鼠模型中，发现其通过促进表皮干细胞和毛细血管的再生促进皮肤愈合［22］。也有学者用hAMSCs与hAECs细胞构建双层膜结构的皮肤组织，发现其与人皮肤组织有相似的形态，拥有表皮和真皮，且能成功修复无胸腺小鼠的全层皮肤缺损［22］。

在移植hAMSCs入四氯化碳诱导的小鼠肝硬化模型中实验中，发现其能减少肝细胞凋亡，促进肝细胞再生，改善肝的纤维化［23］。这为临床提供了一种治疗肝纤维化疾病的新方法。

Lange-Consiglio等［24］首次比较了羊膜间充质干细胞与BM-MSCs在治疗马的肌腱、韧带损伤的疗效，结果发现羊膜间充质干细胞的疗效优于BM-MSCs。还有学者研究证实BM-MSCs的一些治疗应用可被羊膜间充质干细胞等其他来源的间充质干细胞所取代，包括移植物抗宿主病的治疗［25］。

Han等［26］通过流式细胞分析发现表达于女性生殖系统及妊娠子宫中的HOXA9、HOXA10、HOXA11基因也表达于羊膜来源的间充质干细胞上，并通过相关实验推断其可能作为子宫干细胞疗法的新来源。

Sakuragawa等发现羊膜间充质干细胞表达神经胶质祖细胞的表型。最近又有研究证实hAMSCs有可能应用于神经胶质瘤的治疗。

3 展 望

hAMSCs具有取材方便、来源广泛、不易受污染、几乎不存在伦理学争议、分离培养方法简单、免疫原性低、细胞增殖能力强、强分化潜能等众多优越性，使其在再生医学应用中具有良好的应用前景。但目前仍有许多需要解决的问题：（1）hAMSCs的分离纯化技术还有待提高；（2）hAMSCs的准确鉴定方法还有待研究；（3）hAMSCs在体内存活、迁移、分化的机制仍需进一步的探索研究；（4）hAMSCs在体内成瘤性方面的研究还很少。相信随着对hAMSCs更加深入的研究，未来必定能充分发挥hAMSCs的优势，将其广泛应用于临床上的治疗。

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