白术多糖对胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响

王　鹤　陈拥军　张中华

湖南省张家界市人民医院肿瘤科，湖南　张家界　427000

白术多糖对胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响

王鹤陈拥军张中华*

湖南省张家界市人民医院肿瘤科，湖南张家界427000

【摘要】目的：探讨白术多糖对胃癌细胞SGC-7901凋亡的诱导作用。方法：采用不同浓度(30、60、120mg/ml)、不同时间(24、48h)白术多糖注射液处理SGC-7901细胞。流式细胞仪检测细胞凋亡，Westernblot检测Bax、Bcl-2蛋白表达，RTRCR检测p53mRMA。结果：白术多糖注射液对SGC-7901细胞体外凋亡具有促进作用，并呈现剂量及时间成正相关；白术多糖注射液处理后，SGC-7901细胞Bax蛋白表达及Bax/Bcl-2蛋白表达比值显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低，并呈现剂量及时间依赖性；SGC-7901细胞P53mRNA表达随白术多糖浓度的增高而增强。结论：白术多糖促进人胃癌细胞SGC-7901的凋亡，其作用机制可能与上调Bax、p53mRNA和下调Bcl-2表达有关。

【关键词】白术多糖 SGC-7901；细胞凋亡；机制研究

白术为我国常用中药之一，为菊科植物白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz)的干燥根茎，其性温，味甘苦，具有健脾益气、燥湿利水的功效，临床用于治疗脾胃气弱、泻泄、汗出、胎动不安等。药理研究表明，多糖是中草药发挥独特疗效的重要物质基础，并发现白术多糖能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡[1]。研究采用体外培养方法，观察了不同浓度白术多糖对人胃癌细胞株SGC-7901凋亡和对Bax、Bcl-2、P53mRNA 表达的影响，为白术多糖抗胃癌的临床应用提供实验基础。

1材料与方法

1.1材料胃癌细胞株SGC-7901(中南大学湘雅医院肿瘤研究所)；白术多糖(陕西慈缘生物技术有限公司)；小牛血清、1640培养基、胰蛋白酶、PBS缓冲液(Gibco公司)；MTT(Sigma公司)；Bcl-2、Bax单抗(Santa Cruz公司)；凋亡试剂碘化丙啶(PI)和Annexin-V-FITC凋亡试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；Trizol试剂(invitrogen)；DSS(Sigma公司)；Taq酶(鼎国公司)；逆转录试剂盒(promega公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养常规复苏胃癌细胞株SGC-7901，按贴壁方法培养，用含有双抗(每100ml分别含青霉素1万单位和链霉素10mg)及10%胎牛血清的DMEM培养液，然后用灭菌的5.6% NaHCO3调pH值至7.2，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每48h用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2细胞凋亡率检测收集对数生长期细胞，DMEM培养液调整细胞浓度为3×104个/ml，将细胞加至96孔板，500μl/孔,另设不加细胞只加培养液的空白对照孔。将细胞置于37℃、5%CO2温箱中培养12h后，加入终浓度为30、60、120mg/ml的白术多糖并在不同时间点(24、48h)对SGC-7901细胞进行预处理，每组设3个复孔，共4组。细胞置37℃、5%CO2温箱中培养，培养结束后1200r/min，离心4min，弃上清液，用流式细胞仪按照试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.2.3Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达30、60、120mg/ml白术多糖注射液处理细胞48h后，提取胞质蛋白，按照Western blot操作步骤进行Bax、Bcl-2蛋白表达检测。

1.2.4RT-PCR检测p53mRNA用Trizol提取总RNA，然后进行逆转录(RT)及多聚酶链式反应(PCR)。基因扩增条件为：94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min；进行31个循环，最后54℃10min结束反应。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下观察并拍照，用Flour Chem V2.0凝胶成像分析软件分析不同组别DNA扩增带的灰度值，以灰度值(p53)/灰度值(β-actin)作为基因 p53mRNA的半定量指标。引物由上海生工公司合成，具体如下。

表1　合成的引物序列

2结果

2.1白术多糖对SGC-7901细胞体外凋亡率的影响实验中观察到各组胃癌细胞数明显减少，胞体椭圆变形多发，同时可见细胞坏死碎片。从表2可知，在不同预处理时间点，不同浓度白术多糖对人胃癌SGC-7901细胞体外凋亡具有促进作用，且与作用时间和处理剂量呈现正相关性。白术多糖浓度越高则对SGC-7901凋亡促进作用越明显(P<0.01)；在同一浓度条件下，白术多糖处理时间越长则对SGC-7901细胞凋亡促进作用越明显(P<0.01)。

表2　不同浓度白术多糖对SGC-7901细胞体外凋亡率的影响 ±s)

注：与对照组比较，*P<0.01；与24h组比较，▲P<0.01。

2.2白术多糖对SGC-7901细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响不同浓度白术多糖处理人胃癌SGC-7901细胞48h后，Bcl-2蛋白表达显著降低，而Bax蛋白表达显著升高，前者与白术多糖浓度呈负相关，后者与白术多糖浓度呈正相关，说明二者可能与白术多糖促进 SGC-7901细胞的凋亡机制相关，具体见表3。

表3　不同浓度白术多糖对凋亡细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响±s)

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.3白术多糖对SGC-7901细胞p53mRNA表达的影响由表4可知，随着白术多糖浓度的增高，SGC-7901细胞p53mRNA表达逐渐增强，说明白术多糖对促进SGC-7901细胞凋亡与p53基因有关系。

表4　不同浓度白术多糖对SGC-7901细胞p53mRNA表达的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3讨论

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着重要的作用，对生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育起着重要的作用。细细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。一个严密完整的程序化死亡过程，需在基因表达的激活、特定信号转导通路的启动等调控下进行的自性、有序性死亡，是维持细胞内环境稳定的重要机制[2]。

白术多糖是一种多效的天然活性物质，具有明显的免疫增强作用[3]，白术多糖能显著增加小鼠胸腺和脾脏质量[4]，能提高大鼠外周血白细胞的含量及血清免疫球蛋白和补体水平，增加NBT阳性率和血清溶菌酶的含量，促进外周血、脾脏T/ B淋巴细胞转化率[5]。Zhang等[1]研究发现，注射白术多糖后能明显减小S180荷瘤小鼠和Lewis肺癌小鼠的瘤重和瘤体比，明显抑制肿瘤的生长，说明其能降低瘤细胞的增殖率。实验中，白术多糖干预后，胃癌细胞SGC-7901凋亡率能明显提高，还可促进Bax蛋白表达的上调和Bcl-2蛋白表达的下调以及上调p53mRNA的表达。研究发现[6]，Bcl-2是抑制细胞凋亡基因，而Bax是促进细胞凋亡的基因，二者是调控细胞凋亡的重要组成部分。p53基因定位于人类染色体17p13.1，由11个外显子组成，编码393个氨基酸组成的53 000的核内磷酸化蛋白，全长约20kb。其参与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、凋亡等，其激活可加快肿瘤细胞的凋亡。

综上所述，白术多糖可能通过上调Bax、p53mRNA和下调Bcl-2表达促进人胃癌细胞SGC-7901的凋亡，但其是否可以诱导其他基因，以及具体介导通路仍需深入研究和探讨。

参考文献

[1]Zhang Y Q, Xu S B, Lin Y C, et al. Antagonistic effects of 3 sesquiterpene lactones from macrocephala koidz on rat uterine contraction in vitrol [J]. Acts Pharmacol Sin,2000,21(1): 91-96.

[2]Benderska N, Chakilam S, Hugle M, et al. Apoptosis signalling activated by TNF in the lower gastrointestinal tract-review [J]. Curr Pharm Biotechnol, 2012(13): 2248-2258.

[3]段启，许冬谨，刘传祥.白术的研究进展[J].中草药，2008，38(12):165-167.

[4]常云亭，孙吉兰，邱世翠，等.白术对小白鼠免疫功能的影响[J].滨州医学院学报，2003，28(5):32-33.

[5]胡晓蕾，胡迎利，汪以真.白术及白术多糖对SD大鼠生长性能和免疫功能的影响[J].中国兽药杂志，2006，28(1):6-10.

[6]董雅洁，高维娟. Bcl-2、bax、caspase-3在细胞凋亡中的作用及其关系[J]. 中国老年学杂志 2012，22(12): 4828-4830.

(收稿日期：2015.09.07)

【中图分类号】R285.5

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517(2015)24-0010-02

通信作者：张中华，主任医师，研究方向：肿瘤。