HPVL1壳蛋白与P16蛋白联合检测在宫颈癌前病变中的临床意义*

罗阳刚，吕玉宇(.四川省宣汉县人民医院病理科 63650；2.重庆市第五人民医院病理科 400062)



·论 著·

HPVL1壳蛋白与P16蛋白联合检测在宫颈癌前病变中的临床意义*

罗阳刚1，吕玉宇2△
(1.四川省宣汉县人民医院病理科 636150；2.重庆市第五人民医院病理科 400062)

目的 研究HPVL1壳蛋白与P16蛋白联合运用在宫颈癌前病变诊断中的临床意义及对转归的预测价值。方法 对208例TCT异常且HR-HPV阳性的患者进行宫颈活检并根据病理结果分组，同时检测其HPVL1壳蛋白和P16蛋白并根据两种抗体表达情况分为4组，并对其中随访到的155例患者进行HPV转阴分析。 结果HPVL1壳蛋白和P16蛋白在不同级别宫颈组织中的表达均不同，CINⅠ组的L1壳蛋白阳性率高于其他CIN组(P<0.01)，≥CINⅢ组的P16蛋白阳性率高于其他3组(P<0.01)；随访病例中HPVL1壳蛋白(+)/P16蛋白(-)的转阴率高,尤其在CINⅠ患者中该组高于其他几组(P<0.05)。结论HPVL1壳蛋白与P16蛋白联合检测可成为诊断及预测宫颈病变的一个有效指标。

宫颈癌前病变;HPVL1壳蛋白;P16

宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，病死率现已跃居妇科肿瘤之首[1]。早期诊断宫颈上皮内瘤样变(CIN)是预防宫颈癌的重要手段。研究证实，宫颈癌和CIN主要是由高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)持续感染所引起，但只有10%左右的HPV感染者会发生宫颈上皮的不典型增生和癌变[2]。现行的宫颈液基细胞学(TCT)联合HPV检测的筛查方法大大降低了浸润癌的病死率，但同时也给临床诊断和治疗带来了巨大困扰，致使部分CIN过度治疗。因此，如何进一步改善筛查方法，逐步将CIN患者分流，对宫颈癌及癌前病变的研究具有重要意义。

国内外研究报道，在CIN中P16蛋白与HR-HPV相关且随病变级别增高表达增强[3]，HPV L1壳蛋白与HPV早期感染相关而消失于病毒整合到宿主DNA以后[4]。本研究选用HPV L1壳蛋白和P16蛋白作为早期诊断宫颈癌前病变的辅助指标，结合TCT和HR-HPV检测，通过随访研究宫颈病变患者的HR-HPV转阴率以期能更准确地预测CIN的生物学行为及其可能的进展,探索更加合理、有效诊断处理CIN的方案，指导临床医师对其进行个性化治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择重庆市第五人民医院2012年9月至2014年2月TCT异常且HR-HPV检测阳性的妇女208例，年龄23～77岁，平均(49±7)岁，所有研究对象均行宫颈活检，以病理结果作为金标准对初次检查结果行对照研究，分为慢性炎症组72例，CINⅠ组61例，CINⅡ组36例，CINⅢ+癌组39例。随后记录6～24个月间随访到的155例研究对象的HR-HPV复查结果，包括进行治疗[抗病毒药物和(或)手术治疗]和未治疗(观察随访)的所有病例，其中慢性炎症组65例(2例治疗，44例未治疗)，CINⅠ组49例(15例治疗，34例未治疗)，CINⅡ组18例(18例均治疗)，CINⅢ+癌组23例(23例均治疗)；最后根据前期活检标本HPV L1 壳蛋白及P16蛋白表达情况分为4组，即HPV L1壳蛋白(+)/P16蛋白(-)、HPV L1壳蛋白(+)/P16蛋白(+)、HPV L1壳蛋白(-)/P16蛋白(+)、HPV L1壳蛋白(-)/P16蛋白(-)，分析比较各级别CIN患者HR-HPV转归情况。入选病例均有性生活史，无子宫切除史或者宫颈手术史，无激素及免疫抑制治疗史，非妊娠妇女。所有病例按照规范流程行病理学诊断，均由2位病理医师确诊。

1.2 方法

1.2.1 HPV检测 利用德国QIAGEN公司的第二代杂交捕获法(HC-2) 采用全长8 000个碱基对的RNA混合鸡尾酒探针，利用核酸杂交和化学发光信号放大法，检测WHO确定的14种HR-HPV。采用仪器判读，当检测值不低于1.0 pg/mL即为阳性。

1.2.2 HPV L1壳蛋白检测 采用赛泰-细胞/组织HPV染色试剂盒(美国爱迪旺斯医疗科技有限公司)，本试剂能够识别28型宫颈癌相关HPV亚型的HPV L1壳蛋白，包括6、11、16、18、31、33、45 和58 型等。按试剂说明书逐步操作：HE切片处理好后待自然风干，逐步经过梯度乙醇和蒸馏水分别湿润玻片，柠檬酸漂洗，加入HPV L1、抗体、二抗，并行杂交后RNA酶及免疫组化染色，封片诊断。

1.2.3 P16蛋白检测 单抗p16INK4a(Gene，克隆号5B10)免疫组织化学染色。抗原经高压锅高温修复，免疫组化按二步法操作，二氨基联苯胺(DAB)显色，复染，封片。病变细胞核伴(或)细胞质着色。每批染色均设阳性及阴性对照片。

1.3 统计学处理 应用SPSS19.0软件对数据进行分析，计数资料以率表示，各组间的比较采用χ2检验或 Fisher精确检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组宫颈病变组织中HPV L1壳蛋白和P16蛋白的表达情况 比较各组HPV L1壳蛋白表达情况，差异有统计学意义(χ2=33.118，P<0.01)。CINⅠ组的L1壳蛋白阳性率大于CINⅡ组(χ2=15.771，P<0.01)及CINⅢ+癌组(χ2=26.394，P<0.01)，差异均有统计学意义；慢性炎症组的L1壳蛋白阳性率大于CINⅠ组(χ2=10.231，P<0.05)及CINⅢ+癌组(χ2=7.843，P<0.05)，差异有统计学意义；而其他几组的L1壳蛋白阳性率差异无统计学意义。比较各组P16蛋白表达情况，差异有统计学意义(χ2=112.152，P<0.01)。CINⅢ+癌组的P16蛋白阳性率高于慢性炎症组(χ2=104.601，P<0.01)、CINⅠ组(χ2=42.779，P<0.01)及CINⅡ(χ2=13.139，P<0.01)，差异均有统计学意义。见图1、2和表1。

2.2 155例患者随访情况 本研究中慢性炎症患者P16蛋白均为阴性， L1壳蛋白(+)和L1壳蛋白(-)的HPV转阴率比较，差异无统计学意义(P=0.314)；治疗组L1壳蛋白(+)和L1壳蛋白(-)的HPV转阴率比较，差异无统计学意义(P=0.855)；未治疗组L1壳蛋白(+)和L1壳蛋白(-)的HPV转阴率比较，差异无统计学意义(P=0.212)；L1壳蛋白(+)的治疗组与未治疗组HPV转阴率比较，差异无统计学意义(P=0.920)；L1壳蛋白(-)的治疗组与未治疗组HPV 转阴率比较，差异无统计学意义(P=0.245)，见表2。

图1 慢性宫颈炎 HPV L1壳蛋白(+)(免疫组化，×200)

图2 CINⅢ P16蛋白(+)(免疫组化，×400)

组别nHPVL1壳蛋白+-阳性率(%)P16蛋白+-阳性率(%)慢性炎症72264636．11ab0720．00eCINⅠ61392263．93ad18439．51eCINⅡ3682822．22abc231363．89eCINⅢ+癌3943510．26abd38197．43e

注： HPV L1壳蛋白各组间比较，aP<0.05；与CINⅠ比较，bP<0.05；与慢性炎症组比较，cP>0.05；与其他各组比较，dP<0.05。P16蛋白各组间比较，eP<0.01。

表2 随访慢性炎症组[抗病毒药物和(或)手术治疗]65例患者的HR-HPV 转归情况

注：与同组内L1壳蛋白(-)比较，aP>0.05；与未治疗组相比，bP>0.05。

比较CINⅠ患者各组间HPV转阴率，差异有统计学意义(χ2=9.814，P=0.02)。HPV L1壳蛋白(+)/P16蛋白(-)的转阴率高于其他几组，与HPV L1壳蛋白(+)/P16蛋白(+)、HPV L1壳蛋白(-)/P16蛋白(+)比较均是P=0.042，与HPV L1壳蛋白(-)/P16蛋白(-)比较P=0.031，差异均有统计学意义；而其他几组的HPV转阴率之间差异均无统计学意义(P=0.954)。比较各组内手术患者与未手术患者的转阴率差异均无统计学意义；HPV L1壳蛋白(+)/P16蛋白(-)、HPV L1壳蛋白(+)/P16蛋白(+)、HPV L1壳蛋白(-)/P16蛋白(+)、HPV L1壳蛋白(-)/P16蛋白(-)4组中的手术患者转阴率比较差异无统计学意义(P=0.387)，但这4组中未手术患者的转阴率比较差异有统计学意义(χ2=8.434，P=0.038)。见表3。

由于CINⅡ组和CINⅢ+癌组随访到的患者均行手术治疗且例数较少，两者合并为高级别CIN+癌组，暂未行统计差异分析，但表4显示，各组术后HR-HPV转阴率有明显差异，HPV L1壳蛋白(+)/P16蛋白(-)的患者转阴率较高。

表3 随访CINⅠ组49例患者的HR-HPV转归情况

表4 随访高级别CIN+癌组41例患者术后HR-HPV转归情况

3 讨 论

宫颈细胞学检查联合HR-HPV病毒检测提高了早期宫颈癌和癌前病变的检出率，但并不是所有的CIN都进展为癌[5]，有研究显示CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ发展的概率分别是15%、30%、45%，持续的概率分别是32%、35%、56%，消退的概率分别是57%、43%、32%[6]。因此，评价HPV感染和CIN进展的危险性是处理宫颈癌前病变的一个重要依据，本课题通过对随访患者HR-HPV转阴率的研究，力求探寻一种可以将宫颈病变中有潜在发展或有自愈可能的病例分开的方法，以达到对疾病分流、对患者进行个性化治疗的目的。

HPV L1壳蛋白是一种由HPV基因组LR区编码的核蛋白，表达于所有亚型的HPV病毒。HPV可长期存在于基底层细胞内，L1壳蛋白的合成与鳞状上皮的成熟过程有关，其在病毒颗粒完成复制后高表达于表层细胞；但在病毒DNA整合到宿主细胞以后逐渐消失[4]，有人将这解释为L1基因启动子的隔离作用使L1壳蛋白表达缺失[6]。同时，HPV L1壳蛋白是保护性抗原，能诱发机体的免疫反应使局部形成高浓度的免疫抗体，当感染细胞的HPV L1数量快速减少时可能发生免疫逃逸，造成CIN细胞逃脱机体免疫监视及清除，若免疫缺失持续存在可导致CIN细胞异常增殖发展成癌[7]。有研究提出HPV L1壳蛋白表达缺失是HPV相关恶性转化的分子基础[8]。在HR-HPV基因中存在L1壳蛋白变异体，不能组装成成熟的病毒颗粒，导致细胞中大量的病毒DNA复制整合进入宿主细胞，感染细胞失控性增殖而恶性转化[9]。国内外研究显示，低级别CIN表达L1壳蛋白，随着宫颈病变级别的增高其表达率呈下降趋势，在大多数高级别CIN及癌不表达[10-12]。本研究结果表明，随着细胞异型性及病变程度的加重，CINⅠ中L1壳蛋白的表达率高于CINⅡ(P<0.01)、CINⅢ+癌(P<0.01)。因此，可以通过检测HPV L1壳蛋白表达分析HPV与宿主基因的整合情况，其结果为HPV L1壳蛋白可预测CIN的预后及转归提供了有力依据。

P16基因又称为多肿瘤抑癌基因，在多种原发性肿瘤中表达缺失，相反在宫颈癌及CIN中出现过度表达。P16蛋白过度表达可能与HPV持续感染有关，已经证实一过性HPV感染不会出现P16过表达现象。在宫颈癌及癌前病变中存在P16-cyclinD-CDK4-pRB精细调节级联，pRB-E2F复合物负反馈抑制P16的转录和翻译[13]。当HPV整合进入宿主细胞后，E7癌蛋白竞争性抑制CDK4与pRB蛋白结合，使pRB蛋白失活，P16失去负反馈抑制，激活了E2F使其转录和翻译水平相应提高，从而导致P16的过表达，意味着细胞已被启动了癌变的程序[14]。此外，也有学者推测在肿瘤发生中可能存在非HPV依赖的P16蛋白调节机制。本研究结果显示，不同级别宫颈病变中P16蛋白阳性率差异有统计学意义(P<0.01)，CINⅢ以上的病变中高表达，在炎症及CINⅠ中低表达。不同学者的研究均显示P16蛋白与宫颈癌和CIN病变程度及进展有关[3]。因此，作者认为P16 蛋白可作为宫颈高级别病变的辅助标志物。

HPV L1壳蛋白表达于宫颈低级别病变，随着病变进展，表达逐渐下降至缺失，而P16蛋白表达则呈增强趋势，HPV L1壳蛋白与P16蛋白联合检测将更有助于判断宫颈病变的进展程度。本研究对宫颈组织中HPV L1/P16着色方式分组随访，其结果显示：HPV L1壳蛋白(+)/P16蛋白(-) CINⅠ患者其病毒转阴率高于其他三组，该组病毒虽然处于复制状态但未整合进入宿主基因组，机体仍具有相应的免疫反应且pRB通路正常运行，能诱发机体的免疫反应而清除病毒，可被认为是低危型组，提示HPV L1壳蛋白(+)/P16蛋白(-)时病变有自愈的可能；而HPV L1壳蛋白(-)/P16蛋白(+)组HPV病毒已处于整合状态，pRB通路被抑制而没有相应的免疫反应，高级别CIN中此组HPV转阴率最低，可被认为是高危型组，必须提高警惕，必要时行阴道镜检查并行活检以明确诊断，防止漏诊；HPV L1壳蛋白(-)/P16蛋白(-)和HPV L1壳蛋白(+)/P16蛋白(+)为不确定型组，建议患者定期随访。本研究比较了炎症到CIN病变的转阴率后可以看出，HPV L1壳蛋白和P16蛋白联合运用在CIN病变尤其是CINⅠ中起到了有效的分流作用，而在炎症患者未见明显指导意义。

目前关于HPV L1壳蛋白与P16基因有较多的基础和临床研究，结论一致认为两者与宫颈癌及癌前病变的相关性，并且已经探明部分发生机制，但缺乏大量随访研究。本课题以宫颈组织形态学为基础，通过随访CIN患者的HR-HPV转阴率，将HPV L1壳蛋白与P16蛋白联合检测应用于CINⅠ患者的分流，为其成为诊断及预测宫颈病变的有效指标提供了循证医学所必需的临床流行病学及统计学资料，值得未来长期大样本随访加以深入研究。

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Clinical significance of combined detection of HPV L1 capsid protein and P16 protein in cervical precancerous lesion*

LUOYang-gang1,LYUYu-yu2△
(1.DepartmentofPathology,XuanhanCountyPeople′sHospital,Xuanhan,Sichuan636150,China;2.DepartmentofPathology,ChongqingMunicipalFifthPeople′sHospital,Chongqing400062,China)

Objective To evaluate the clinical significance of the combination detection of human papillomavirus(HPV) L1 capsid protein and p16 protein in the diagnosis of cervical precancerous lesion and its predictive value to disease outcome.Methods 208 cases of abnormal in thinprep cytologic test and high risk(HR)-HPV positive were performed the cervical biopsy and grouped according to the histopathologic test.Meanwhile,these cases were detected the HPV L1 capsid protein and the p16 protein and then divided into 4 groups according to the expression situation of these two kinds of antibody.Among them,155 followed up cases were performed the analysis of HPV negative conversion.Results The expression of L1 and P16 was different among different grades of cervical tissues,the positive rate of L1 in the cervical intraepithelial neoplasia(CIN)Ⅰ group was higher than that of other CIN groups(P<0.01) and the positive rate of P16 in the ≥CINⅢ group was higher than that in the other 3 groups(P<0.01).Among the follow-up cases,the negative conversion rate in the HPV L1(+)/P16(-) was higher,especially which in the CINⅠgroup was higher than other groups(P<0.05).Conclusion The combined detection of HPV L1 capsid protein and P16 protein can be used as an effective indicator in the diagnosis and prediction of cervical lesions.

cervical intraepithelial neoplasia; HPV L1 capsid protein; P16 protein

重庆市卫生和计划生育委员会医学科研资助项目(20142170)；重庆市南岸区卫生和计划生育委员会医学科研资助项目。

罗阳刚，男，主治医师，大专，主要从事女性生殖系统临床病理诊断。△

，E-mail：lvyuu@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.22.009

A

1672-9455(2015)22-3314-04

2015-03-22

2015-08-31)