血小板裂解液差异蛋白在原发免疫性血小板减少症诊断中的临床应用研究*

吴鹏强，汤计瑞，韩丽英(泸州医学院附属医院血液科，四川泸州 646000)



·论 著·

血小板裂解液差异蛋白在原发免疫性血小板减少症诊断中的临床应用研究*

吴鹏强，汤计瑞，韩丽英△(泸州医学院附属医院血液科，四川泸州 646000)

目的 通过对原发免疫性血小板减少症(ITP)患者血小板裂解液差异蛋白的研究,了解其与ITP发病的关系,为ITP的诊断建立一种简便快速、灵敏度高、特异性好的实验方法。方法 应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术检测64例ITP患者及42例健康者血小板裂解液，获得血小板蛋白质谱图，筛选出差异蛋白，结合人工神经网络(ANN)，建立ITP诊断模型。结果 质荷比(m/z)为3 549.17、7 678.09的蛋白在ITP组中高表达，质荷比为5 328.29、7 894.32的蛋白低表达。诊断模型的灵敏度93.3%，特异度82.6%。结论 基于血小板蛋白质谱建立的ANN模型可能对ITP的诊断具有一定的临床价值。

原发免疫性血小板减少症； 蛋白质组学； 表面增强激光解吸电离飞行时间质谱

原发免疫性血小板减少症(ITP)是一种常见的由抗血小板膜抗体导致外周血小板破坏而引起的出血性疾病，2007年国际工作组(IWG)召集ITP专家在意大利举行会议，强调其为免疫机制所介导。成人发病率为1/20 000～1/10 000，临床上以皮肤、黏膜及内脏出血较多见。在ITP发病过程中血小板膜抗原性发生改变是疾病的根本所在，检测血小板表面的抗原，寻找差异蛋白，可能更易了解疾病的本质特征。由于血小板无细胞核，与其他有核细胞及血清相比蛋白成分简单，因此检测血小板裂解液可以直接获得ITP的疾病特征，避免血清中高丰度蛋白质的干扰。采用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)-蛋白质芯片技术检测ITP患者和健康者血小板裂解液，在血小板蛋白质水平全景式比较指纹图谱，寻找差异蛋白,作为ITP诊断的生物标志物，进一步完善ITP诊断模型。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年10月至2012年11月本院血液科收治的按IWG2009年ITP诊断标准诊断为ITP的住院患者,所有患者均为初诊[1]。健康对照组均来自本院健康体检中心。ITP组：ITP患者64例，男22例，女42例，年龄15～78岁，血小板(2～30)×109/L。健康对照组：健康体检者42例，男20例，女22例，年龄18～65岁，血小板(100～300)×109/L，组间年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 仪器与试剂 前列环素应用液、乙腈、复方枸橼酸钠(ACD)液、芥子酸(SPA)、三羟甲基氨基甲烷(tris-HCl)缓冲液、3-环乙胺-l-丙磺酸3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、磷酸盐缓冲液(×10)、高效液相色谱液(HPLC H2O)等均购自美国Sigma公司。蛋白质芯片时间质谱分析仪(PBSⅡ/C)、Au蛋白芯片由美国Ciphergen公司生产。

1.3 方法

1.3.1 样本采集与制备 抽取清晨空腹静脉血2～3 mL,置于枸橼酸抗凝管内，立即加入前列环素应用液(Sigma-Aldrich公司，美国)2～3 μL，放平颠倒混匀，动作要轻柔。离心15 min，用移液管将上层富血小板血浆(PRP)置于新试管内，加2～3 μL前列环素应用液。混匀后，离心20 min,弃上层血浆(注意不要吸到贴壁的蛋白)，加入(ACD)液(Sigma-Aldrich公司，美国)0.5 mL，使血小板重悬。离心20 min，弃上清，加入0.1 mL去离子水。在-80与37 ℃之间反复快速冻融5次，离心20 min。获得的上清液即为血小板裂解液,每30 μL分装一管，每个样本分装3管，-80 ℃冰箱保存备用。所有操作均在低温下进行，分装时不能吸入下层的细胞，发生溶血的样本应舍弃。

1.3.2 上样及质谱检测 将血小板裂解液置于冰盒表面融化后，取5 μL裂解液、5 μL SPA于新离心管(0.2 mL)底，将血小板裂解液与SPA混合后点样，每个点加2 μL，晾干；待芯片表面晾干后，点加1 μL加能量吸收分子(EAM)，室温晾干约15 min，重复点加1 μL，晾干后，每孔加入200 μL结合缓冲液，室温振荡洗涤3次，每次5 min，甩掉缓冲液，拍干后再加入200 μL HPLC液，洗脱2次，快速倾去，拍干。晾干后点加l μL SPA，10 min后重复一次，晾干后即可上机测量。采用PBSⅡ/C型蛋白质指纹图谱仪对结合蛋白质的金芯片进行检测，Ciphergen Proteinehip软件自动采集质谱数据。

1.4 采集数据 用已知相对分子质量的标准蛋白质芯片All-in-one(peptide or protein)(塞弗吉公司，美国)将获得的蛋白质分子量误差校正到小于0.01，作好内标。根据P值小、均值差异大、标准差小的原则，采用Biomarker Wizard 3.1软件筛选出差异蛋白。结合人工神经网络，以32例ITP患者和21例健康者训练组建立诊断模型，诊断模型采用输入层含5个神经元，隐含层含5个神经元和输出层含1个神经元。设定训练组ITP患者的输出值为1，健康者的输出值为0，以0.5为界。学习率为0.01，训练1 000次，建立并储存ANN诊断模型。采用验证组盲法检测诊断模型，进行模拟仿真计算，得出模型的诊断效能。

2 结 果

表1 ITP组和健康对照组差异蛋白质的平均值、 标准差及P值比较

注：按质荷比的P值升序排列。

2.2 诊断模型的建立和效能评价 将训练组(包含32例ITP患者、21例健康者)的上述4个蛋白质峰强度输入BP神经网络，建立ITP诊断模型。输入层有4个神经元，隐含层有5个神经元，输出层有1个神经元。输出值越接近1，诊断ITP的可能性越大，以0.5为界。此模型的学习率设为0.01，学习次数为1 000次。用验证组(包括另32例ITP和21例健康者)进行盲法测试，结果显示，32例ITP样本有4例误判，21例健康者有2例误判。该模型诊断ITP的灵敏度93.3%，特异度82.6%，阳性预测值87.5%，阴性预测值82.6%。见表2。

表2 诊断模型1效率分析(n)

2.3 差异蛋白的初步鉴定 根据获得差异蛋白质质荷比，在SWISS Prot蛋白质数据库中查询相对应的蛋白质。网址为：http://web.expasy.org/tagident/，查询结果如下：m/z 3 543的蛋白质对应为神经肽W-30，m/z 7 681对应的为血小板第4因子，m/z 5 322对应的为β-防御素，m/z 7 894对应的为促性腺释放素前体。

3 讨 论

ITP是最常见的出血性疾病之一，以皮肤黏膜、内脏出血较常见。目前，ITP的发病机制不明，大多数研究表明免疫机制在ITP的发病过程中起关键作用[2]。血小板自身抗体导致血小板破坏增加,也可抑制骨髓巨核细胞，使其数量减少、形态变化、成熟障碍，导致血小板更新减少，无效血小板生成[3]。有报道称血小板自身抗体不仅破坏血小板，还可引起血小板功能障碍。

近年来，蛋白质组学的研究越来越受到重视。蛋白质组是指细胞、组织或器官的基因组所表达的全部蛋白质[4]。作为生命活动的执行者，蛋白质表达水平的高低与疾病发展、转归、药物作用或毒素作用直接相关。疾病的发生引起蛋白质的改变，研究蛋白质可为获得疾病的特征提供线索。SELDI-TOF-MS技术结合蛋白组学最早用于恶性肿瘤生物标志物筛选，广泛应用于卵巢癌、肝癌、乳腺癌等多种疾病，对筛选和鉴定肿瘤特异性标志物提供有力工具，是研究蛋白质组学的理想平台[5]。Craddock等[6]应用该技术发现α-防御素是精神分裂症易感性标志物。Rolland[7]应用SELDI-TOF-MS技术检测非霍奇金淋巴瘤不同亚型，获得3个有意义的差异蛋白质，经免疫组化鉴定其中有两个蛋白质分别为组蛋白H4和H2B，具有促进细胞增殖的作用，可以将套细胞淋巴瘤与小淋巴细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤区分开。Tumblin[8]对镰状红细胞贫血的血浆蛋白质进行研究，质荷比为28.1×103、11.7×103为显著差异蛋白质，经免疫测定法证实分别为载脂蛋白A1、血清淀粉样蛋白A，因此，临床上可以通过检测这2个蛋白质来预测患者的急性疼痛发作期。

本实验采用SELDI-TOF-MS技术直接对血小板裂解液进行研究，采用差异蛋白组学方法，获得4个差异蛋白。m/z 3 543的蛋白质对应为神经肽W-30，脑垂体腺苷环化酶激活肽(PACAP)和血管活性肠通过肽负调控使巨核细胞和血小板生成受损[9-10]。m/z 7 681对应的为血小板第4因子，Pötschke等[11]认为在心肺旁路术后第6天易产生抗血小板因子4/肝素复合物IgG抗体，这些抗体是有免疫介导的药物不良反应，肝素介导的血小板减少症。m/z 5 322对应的为β-防御素，García等[12]采用蛋白质点阵法发现10个生物标志物，通过多变量逻辑回归分析，其中β-防御素2和白细胞介素-4受体(IL-4R)可以作为急性缺血性脑卒中恶化的独立的危险因素。m/z 7 894对应的为促性腺释放素前体。Pazaitou等[13]认为促性腺释放激素和神经肽受体在乳腺癌中表达提示预后不良。

本研究的优点在于能够从小样本量中同时检测大量的蛋白质，从蛋白质的整体水平研究机体的复杂变化，是其他检测技术不能替代的。这个诊断模型的诊断效能高，比单一的蛋白质峰更具说服力，灵敏度和特异度均比传统的单一诊断方法较理想，为ITP的诊断提供了另一种参考。缺点主要是实验样本量较小，诊断模型还需要扩大样本量进一步验证。虽然尽量做到操作均衡，但是研究中仍然存在许多不可控因素，样本中血小板计数较少，尽可能多的从中提取血小板单一成分的技术还有待进一步提高。对于SELDI-TOF-MS技术来说，每个质荷比对应的可能是很多相对分子质量相近的多肽，不能明确C末端、N末端的序列，无法鉴定蛋白的结构、功能和生物学特性，下一步的工作将筛选出的差异蛋白质提纯，PCR基因检测，鉴定蛋白质结构及功能研究。将诊断模型中的蛋白质纯化后制备成探针或试剂盒，可以临床推广应用。

[1]Stasi R,Newland AC.ITP:a historical perspective[J].Br J Haematol,2011,153(4):437-450.

[2]Nugent D,Mcmillan R,Nichol JL,et al.Pathogenesis of chronic immune thrombocytopenia:increased platelet destruction and/or decreased platelet production[J].Br J Haematol,2009,146(6):585-596.

[3]Rodeghiero F.Standardization of terminology,definitions and outcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children:report from an international working group[J].Blood,2009,113(11):2386-2393.

[4]He Y,Zhao YX,Zhu MQ,et al.Detection of autoantibodies against platelet glycoproteins in patients with immune thrombocytopenic purpura by flow cytometric immunobead array[J].Clin Chim Acta,2013,415(1):176-180.

[5]De BM,De SD,Meuwis MA,et al.Challenges for biomarker discovery in body fluids using SELDI-TOF-MS[J].Biomed Biotechnol,2010,2010:906082.

[6]Craddock RM,Huang JT,Jackson E,et al.Increased alpha-defensins as a blood marker for schizophrenia susceptibility[J].Mol Cell Proteomics,2008,7(7):1204-1213.

[7]Rolland D.Identification of proteomic signatures of mantle cell lymphoma,small lymphocytic lymphoma,and marginal zone lymphoma biopsies by surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry[J].Leuk Lymphoma,2011,52(4):648-658.

[8]Tumblin A.Apolipoprotein A-I and serum amyloid A plasma levels are biomarkers of acute painful episodes in patients with sickle cell disease[J].Haematologica,2010,95(9):1467-1472.

[9]Ono A,Naito T,Ito I,et al.Correlations between serial pro-gastrin-releasing peptide and neuron-specific enolase levels,and the radiological response to treatment and survival of patients with small-cell lung cancer[J].Lung Cancer,2012,76(3):439-444.

[10]Peeters K,Loyen S,Van Kerckhoven S,et al.Thrombopoietic effect of VPAC1 inhibition during megakaryopoiesis[J].Br J Haematol,2010,151(1):54-61.

[11]Pötschke C,Selleng S,Bröker BM,et al.Heparin-induced thrombocytopenia:further evidence for a unique immune response[J].Blood,2012,120(20):4238-4245.

[12]García BT,Giralt D,Bustamante A,et al.Role of beta-defensin 2 and interleukin-4 receptor as stroke outcome biomarkers[J].J Neurochem,2014,129(3):463-472.

[13]Pazaitou PK,Chemonidou C,Poupi A,et al.Gonadotropin-releasing hormone neuropeptides and receptor in human breast cancer:correlation to poor prognosis parameters[J].Peptides,2013,42(4):15-24.

Study of clinical study of platelet lysate differential protein in diagnosis of primary immune thrombocytopenia*

WUPeng-qiang,TANGJi-rui,HANLi-ying△

(DepartmentofHematology,AffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To establish a quick and simple diagnostic laboratory method with high sensitivity and good specificity for the diagnosis of primary immune thrombocytopenia ITP by studying platelet lysate differential protein in the patients with ITP for understanding its relationship with the onset of ITP.Methods The platelet lysate was detected in 64 cases of ITP and 42 cases of healthy people by surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry(SELDI-TOF-MS) technology for obtaining the platelet protein mass spectrum.The differential protein was screened and combined with the artificial neural network(ANN) for establishing the diagnostic model of ITP.Results The protein with the mass electron ratio(m/z) of 3 549.17 and 7 678.09 was highly expressed in the ITP group and which of m/z 5 328.29 and 7 894.32 was lowly expressed.The sensitivity and specificity of the diagnostic model were 93.3% and 82.6% respectively.Conclusion The established ANN model on the basis of platelet protein mass spectrum may have some clinical value for the diagnosis of ITP.

primary immune thrombocytopenia； proteomics； SELDI-TOF-MS

泸州医学院青年基金项目(12065)。

吴鹏强，男，主治医师，硕士，主要从事血液系统疾病方面的研究。△

，E-mail:LYHLY@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.019

A

1672-9455(2015)16-2346-03

2015-03-05

2015-04-15)