乳酸脱氢酶催化活性浓度测量的不确定度评定*

袁若愚，季伙燕，王建新，孟舒婷，王惠民,2Δ(.南通大学附属医院检验科，江苏南通 22600； 2.南通大学检验医学研究所，江苏南通 22600)



·论 著·

乳酸脱氢酶催化活性浓度测量的不确定度评定*

袁若愚1，季伙燕1，王建新1，孟舒婷1，王惠民1,2Δ(1.南通大学附属医院检验科，江苏南通 226001； 2.南通大学检验医学研究所，江苏南通 226001)

目的 评定在乳酸脱氢酶(LDH)催化活性浓度测量中不同厂家或批号试剂的不确定度。方法 配制不同厂家或批号LDH试剂，用国际临床化学联合会(IFCC)参考方法分别检测中值和高值两个浓度的混合血清，对所得数据进行配对t检验，计算不同厂家或批号试剂间的不确定度。结果P<0.05表示对不同厂家或批号LDH试剂，所测LDH催化活性浓度结果差异有统计学意义。不同试剂批号对中值和高值混合血清的扩展不确定度U分别为6.52%(k=2)和6.78%(k=2)。结论 不同厂家或批号试剂对LDH催化活性测量有影响，因此，在进行不确定度评定时，应考虑不同厂家或批号试剂的影响。

LDH催化活性浓度； 乳酸锂盐； N-甲基-D-葡糖胺； 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

国际临床化学联合会(IFCC)推荐的乳酸脱氢酶(LDH)催化活性浓度测量方法为手工法，其所需试剂原材料为乳酸锂盐、N-甲基-D-葡糖胺、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、NAD二水合锂盐，但未规定所使用各试剂的生产厂家及批号。每年参加国际参考实验室间质量评价(RELA计划)的国内外参考实验室或候选参考实验室达数十家，各参考实验室均使用IFCC推荐的参考方法，但对相同样本中LDH催化活性浓度的测量结果仍存在差异[1-2]。本实验比较不同厂家或批号试剂对LDH催化活性浓度的影响，评估其不确定度，作为实验室评估测量结果不确定度时的参考[3-4]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 根据国际标准化组织(ISO)导则34，选取南通大学附属医院中、高2种浓度LDH混合血清(中值浓度范围为100～235 U/L，高值浓度范围为360～800 U/L)，先后采用0.45 μm孔径和0.22 μm孔径的醋酸纤维素滤菌膜过滤分装，置-70 ℃保存[5-6]。

1.2 仪器与试剂 仪器：日本日立公司U-3310紫外-可见分光光度计；意大利Hanna公司HI98183型pH计；美国Fluke公司1521点式温度计；德国SartoriusBT25S电子天平；德国Eppendorf reference移液器；北京格瑞恩公司DKB-501A型超级恒温水槽。分光光度计、天平、pH计、温度计和移液器均由南通市计量检定测试所检定，分光光度计、天平、pH计使用前均进行校正。试剂：乳酸锂盐分别购自Sigma公司(批号1为SLBC8966V，批号2为060M5441)、苏州亚科化学试剂股份有限公司(YK2014010801)、日本东京化成工业株式会社(TCIWTTCL-LL)、国药集团化学试剂有限公司(批号1为T20100310，批号2为T20110104)、德国Applichem公司(8R004802)。N-甲基-D-葡糖胺分别购自Sigma公司(批号1为SLBD8581V，批号2为SLBD4908V)、阿拉丁试剂(中国)有限公司(34759)、日本东京化成工业株式会社(批号1为34GFKPB，批号2为A877EHL)。NAD分别购自Sigma公司(021M7015V)、国药集团化学试剂有限公司(20131121)、阿拉丁试剂(中国)有限公司(39720)、美国Amresco公司(批号1为0090C423，批号2为1071C303)。NAD二合水锂盐购自Sigma公司(SLBB8328V)。

1.3 方法 应用IFCC参考测量程序，在日立U-3310紫外-可见分光光度计的反应杯内加入2.000 mL反应液和0.100 mL混合血清标本，完全混合并孵育180 s，在180 s末加入0.200 mL的起始反应液，延滞90 s，测量180 s内吸光度变化率，计算LDH催化活性[7]。用参考方法对上述收集的中值和高值混合血清分别进行测定，每个厂家或批号试剂分别测量中值和高值混合血清各5次。

1.4 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行配对t检验分析，P<0.05表示差异有统计学意义。不同厂家或批号试剂间的不确定度的计算参照下列公式进行。

扩展不确定度 U=k·uc

2 结 果

2.1 不同厂家或批号试剂测定LDH活性统计结果比较 不同厂家或批号乳酸锂盐、N-甲基-D-葡糖胺与NAD测定LDH催化活性浓度值统计结果见表1。

2.2 不同厂家或批号试剂配对t检验分析 为了判断各厂家或批号试剂对LDH催化活性浓度的影响是否具有统计学差异，采用SPSS19.0软件对上述结果进行配对t检验，测定LDH催化活性浓度的乳酸锂盐、N-甲基-D-葡糖胺与NAD厂家或批号的两两比较结果见表2。

表1 不同厂家或批号试剂测定LDH活性统计结果比较

2.3 不同厂家或批号试剂间的不确定度评定结果 根据贝塞尔公式，分别计算不同厂家或批号乳酸锂盐的不确定度结果为u(中值) 3.34 U/L和u(高值) 8.93 U/L，相对不确定度结果为urel(中值) 1.91%和urel(高值) 1.69%；不同厂家或批号N-甲基-D-葡糖胺的不确定度结果为u(中值) 2.26 U/L和u(高值) 9.30 U/L，相对不确定度结果为urel(中值) 1.29%和urel(高值) 1.78%；不同厂家或批号NAD的不确定度结果为u(中值) 4.02 U/L和u(高值) 12.28 U/L，相对不确定度结果为urel(中值) 2.31%和urel(高值) 2.35%。根据以上所得的相对不确定度，计算不同厂家或批号的LDH试剂对中值和高值混合血清的合成不确定度和扩展不确定度。

中值：

高值：

表2 不同厂家或批号试剂配对t检验分析

3 讨 论

目前国内外有关评定在LDH催化活性浓度测量中不同厂家或批号试剂的不确定度方面的研究还较少。本研究比较不同厂家或批号试剂对LDH催化活性浓度的影响，结果表明对不同厂家或批号LDH试剂，所测LDH催化活性浓度结果差异有统计学意义(P<0.05)。计算得到不同试剂批号对中值和高值混合血清的合成不确定度uc分别为3.26%和3.39%，扩展不确定度U为分别为6.52%(k=2)和6.78%(k=2)。

本研究所得结果与德国临床化学与检验医学协会——参考实验室2(DGKL-Rf2)所提供的试剂批号所引起的不确定度1.24%相比有所差异，可能是由于本实验室所用的试剂厂家及批号与DGKL-Rf2所用的不同所引起的。所以，本研究在评定不同厂家或批号试剂对LDH催化活性浓度所引起的不确定度时，应结合自身实验室的实际情况，不宜直接引用其他参考实验室的数据。

因此，在进行不确定度评定时，应考虑不同厂家批号试剂对其的影响；在进行校准和测量能力的评定时，也应考虑不同试剂厂家批号的影响。在今后工作中可以增加不同试剂厂家或批号数目，同时测量多个酶的催化活性浓度，进行长期研究，积累更多的数据，为参考实验室评估测量结果不确定度时提供参考[9]。

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Estimation on measurement uncertainty of lactate dehydrogenase catalytic activity concentration*

YUANRuo-yu1,JIHuo-yan1,WANGJian-xin1,MENGShu-ting1,WANGHui-min1,2△

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine，HospitalAffiliatedtoNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001,China;2.InstituteofLaboratoryMedicine，NantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001,China)

Objective To evaluate the measurement uncertainty of lactate dehydrogenase(LDH) catalytic activity concentration with different manufacturers or different lot numbers.Methods The LDH reagents with different manufacturers or different lot numbers were prepared.The pooled serum with low or high concentrations was measured by the reference method recommended by International Federation of Clinical Chemistry and laboratory medicine(IFCC)．The experimental data were analyzed by paired t test.The measurement uncertainty of lactate dehydrogenase with different manufacturers or different lot numbers was calculated.ResultsP<0.05 indicated that the differences of detected LDH catalytic activity concentrations results for different manufacturers or lot numbers of LDH reagents had statistical significance.The expanded uncertainty (U) of different manufacturers or lot numbers of reagents were 6.52%(k=2) for low concentration and 6.78%(k=2) for high concentration.Conclusion Different manufacturers or different lot numbers of reagents have significant effect on the catalytic activity concentrations of LDH.Therefore,in the detection of measurement uncertainty,the impact of different manufacturers or different lot numbers of reagents should be considered.

LDH catalytic activity concentrations; lithium lactate; N-methyl-D-glucamine； nicotinamide adenine dinucleotide

国家质检总局科研项目(201210066);南通市科技项目(HS2012009)。

袁若愚，女，在读硕士，主要从事生物化学及酶学检验方面的研究。△

，E-mail:whm_jyk@ntu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.003

A

1672-9455(2015)16-2304-03

2015-02-25

2015-04-20)