以GDNF为核心的哺乳动物精原干细胞调控网络

刘欢欢，陈 曦，余树民，宋 品，沈留红，曹随忠，左之才，马晓平

(四川农业大学动物医学院，四川雅安625014)

精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是位于睾丸曲细精管基膜的一类成体干细胞，既可自我更新维持数量稳定，也能在体内定向分化产生精子，调节SSCs 在自我更新和分化之间的平衡是维持动物终身正常精子发生的关键［1］。SSCs 自我更新与分化之间的平衡的维持依赖于精原干细胞微环境，微环境中的胶质细胞源神经营养因子(Glial cell line－derived neurotrophic factor，GDNF)是调控SSCs自我更新和分化的关键因子。

GDNF 属于转化生长因子β(TGF－β)超家族，是调节多种细胞发育和分化的信号分子，在神经系统和泌尿系统的发育中有重要作用［2］。近年来有研究发现，GDNF 也在雄性动物生殖细胞发育和睾丸发育早期中发挥作用［3－4］。研究发现，GDNF 基因功能缺失(GDNF+/－)小鼠能精子发生紊乱，出现唯支持细胞表型;而GDNF 超表达，SSCs 则不能分化形成精子，表明GDNF 在SSCs 自我更新和分化的调节中有重要作用［5］。体外SSCs 培养实验也发现，GDNF在多种哺乳动物的SSCs 增殖、未分化状态的维持、凋亡的抑制方面有重要作用［6－7］。

1 GDNF 的合成调控

睾丸中的GDNF 由支持细胞［5］、管周肌肉样细胞［8］、精母细胞和球形精子［9］分泌，其中支持细胞分泌的GDNF 是睾丸中的GDNF 的最主要来源。支持细胞中GDNF 的呈现曲细精管上皮周期依赖性表达，在小鼠中，GDNF 在Ⅻ－Ⅱ期表达量高，此时期为SSCs 的增殖时期，而在Ⅶ－Ⅷ期，SSCs 分化阶段，GDNF的表达量低［10］。GDNF 的表达受到FGF2、FSH、睾酮、TNF－α 和IL－1β 等［11－12］的调控，其中FSH 是睾丸中GDNF 浓度的最主要调节因子。

2 GDNF 介导的信号通路

GDNF 通过由GDNF 结合受体(GDNF family receptor α1，GFRα1)和跨膜酪氨酸激酶RET(RET proto－oncogen)组成的双受体系统发挥作用，GFRα1和RET 仅在SSCs 中共表达，GFRα1 和Ret 基因敲除动物与GDNF 敲除动物相同的表现型［13］。GDNF与SSCs 膜上的GFRα1 结合形成GDNF－GFRα1 复合物，结合并活化RET，并进一步激活MAPK、SFK和PI3K－AKT 信号通路，进而调节SSCs 的自我更新和分化［14］。

2.1 MAPK 信号通路

MAPKs 包括ERK 和P38 MAPK，其中ERK 信号主要通过调节SSCs 细胞周期相关基因的表达以调节细胞增殖，而P38MAPK 则主要调节SSCs 自我更新。如图1 蓝色线部分所示，GDNF－GFRα1 复合体诱导RET 磷酸化，活化的RET 与含SHC 结构的蛋白结合(如SRC)，促使SHC 活化并与生长因子受体结合蛋白(growth factor receptor－bound protein 2，GRB2)的结合。GRB2 与质膜上的RAS 蛋白结合，激活RAS－ERK1/2 信号通路，诱导cAMP 反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB－1)、激活转录因子(activating transcription factor－1，ATF－1)和环磷酸腺苷反应与案件调节蛋白(cyclic AMP element modulator 1，CREM－1)等转录因子的磷酸化和活化，上调c－FOS、Cyclin A 和细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)的表达。Cyclin A 和CDK2 协同控制细胞进入S 期，CREB－1 和c－FOS 可以增强Cyclin A 的表达和调节有丝分裂G1/S 期的转化，加速细胞进入S期，调节DNA 合成和细胞增殖［15－16］。

此外，GDNF 也能活化P38MAPK 信号通路(图1 绿线部分)，上调BCL6b、ETV5 和LHX1 表达，调节SSCs 的自我更新，但不同遗传背景的SSCs 对该信号通路的反应性有所差异［17］。

GDNF 与GFRα1 结合，活化RET，进而激活RAS－ERK1/2 信号通路［18］(蓝线)、SFK 信号通路［19］(紫线)、PI3K－ATK 信号通路［19］(黄线)和P38 MAPK 信号通路［17］(绿线)。

图1 GDNF 介导的信号通路Fig 1 The GDNF mediated signaling pathways

2.2 SFK 信号通路

SRC 家族激酶(src family kinase，SFK)主要有SRC、YES、LYN 和FYN，其中SRC 和YES 在SSCs对GDNF 的应答中占主要作用［18］。SFK 信号是调节SSCs 自我更新的主要信号，如图1 紫线部分所示，Src 家族激酶活化后，特异性地上调BCL6b、ETV5 和LHX1 的表达，促进SSCs 增殖［19］。

2.3 PI3K-AKT 信号通路

AKT 信号可由SFK 和PI3K 激活，在SSCs 中主要由PI3K 激活，AKT 信号活化后，上调BCL6b、ETV5 和LHX1 的表达，调控SSCs 的自我更新，但AKT 信号并非主要作用于调节SSCs 自我更新而是主要作用于维持SSCs 存活，AKT 除调节BCL6b、ETV5 和LHX1 表达，也调节与SSCs 存活有密切关系的PLZF 和POU5f1 表达(图1 黄线部分)，使用LY294002 阻断AKT 信号后，SSCs 出现显著地凋亡［20］。

3 SSCs 内受GDNF 调控的自我更新相关基因

GDNF 对SSCs 自我更新调控通过调节SSCs 内自我更新相关基因的表达实现，这些因子包括ETS转录相关因子(ETS variant gene 5，ETV5)、原癌基因BCL6 表达蛋白(B－cell CLL/lymphoma 6－member B，BCL6b)和LIM 同源框1 (LIM homeobox 1，LHX1)。

ETV5 又叫ERM(ETS related molecule)，属于ETS 转录因子家族，具有保守的DNA 结合ETS 结构域，在多种器官中表达，在细胞增殖、分化和凋亡等方面有重要作用［18］。在睾丸中ETV5 在SSCs 和支持细胞中均有表达，在动物出生后睾丸发育中有重要作用，是调节SSCs 自我更新的关键因子［21－23］。ETV5－/－小鼠与能生长至成年且可育，但随后出现SSCs 自我更新障碍，最终曲细精管中SSCs 耗竭，形成唯支持细胞表型，而ETV5－/－SSCs 体外增殖能力显著下降［17］。

BCL6b 属于POZ (poxvirus and zinc finger)家族，仅在未分化精原细胞中表达，是SSCs 自我更新又一关键因子［18］。siRNA 体外干扰实验显示抑制BCL6b 表达引起SSCs 集落数量显著降低但并不出现明显的细胞凋亡［22］;而BCL6b 基因敲除小鼠呈现精子发生紊乱，睾丸曲细精管表现唯支持细胞表型［24］。

LHX1 属于同源盒基因LIM 家族，在动物器官发生和细胞分化中发挥重要作用［18］。LHX1 也在未分化精原细胞中表达，主要作用在于维持SSCs 数量稳定［21］。LHX1 基因敲除小鼠在出生前后即发生死亡，siRNA 干扰降低LHX1 表达水平，SSCs 增殖明显受到抑制［20］。但LHX1 超表达SSCs 并不能维持长期增殖，表明LHX1 不能单独维持SSCs 自我更新，需要其他因子的协同作用［17］。

4 小结

综上所述GDNF 与SSCs 膜上的GFRα1 结合形成GDNF－GFRα1 复合物，结合并活化RET，并进一步激活MAPK、SFK 和PI3K－AKT 信号通路，进而调节SSCs 的自我更新和分化。GDNF 调节SSCs 的自我更新和分化是通过改变浓度实现的，高浓度的GDNF 可以显著促进SSCs 增殖，低浓度的GDNF 对SSCs 的数目没有显著的影响，但比较GDNF 和不添加GDNF 培养后的细胞成分发现，添加GDNF 时SSCs 基本维持未分化状态，而不添加GDNF 时SSCs出现不同程度的分化［25］。但具体GDNF 浓度为多少时为高浓度和低浓度仍不明确，以及这一高低浓度是否存在物种的差异性仍有待进一步研究。

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