茭白愈伤组织诱导及基因组多态性分析

李帅，崔海峰，金晔，康璐瑶，叶子弘

（中国计量学院生命科学学院/浙江省生物计量与检验检疫技术重点实验室，杭州，310018）

茭 白 （Zizania latifoliaTurcz） 属 于 禾 本 科（Gramineae）菰属多年生水生宿根性草本植物，无性繁殖，古称菰，主要分布于我国南方区域，已有千年的栽培历史[1，2]，目前是浙江省的主要水生蔬菜，种植面积达2.335 余万hm2，经济效益十分显著。人们所食用的茭白实质上是茭白植株被其内生真菌——菰黑粉菌（Ustilago esculentaP.Henn.）侵染后膨大而成的肥嫩肉质茎，属病态器官，茭白孕茭是由茭白植株与寄生在其体内的菰黑粉菌共同作用的结果。茭白食用茎富含蛋白质、脂肪、糖类、食用粗纤维等，特别是在食用茎未过分老熟时，氨基酸含量多，易吸收，营养价值较高[3]。

田间茭白的种植方式均为无性栽培，新品种选育主要是通过田间茭墩无性系变异筛选获得。茭白植株及其内生真菌（菰黑粉菌）的基因组变异可能在茭白品种选育及生长特性中具有重要作用[4]。DNA 分子标记在植物品种之间亲缘关系和植物资源多样性的检测方面得到大量应用。利用DNA 分子标记可以确定亲本之间的亲缘关系和遗传差异，对亲本之间的遗传距离进行客观的测定，对植物品种进行系统划分[5,6]。因此试验结果一般准确可靠，在实际试验中有着较广的应用面。

本试验通过对双季茭白龙茭2 号进行离体组织培养，诱导获得茭白愈伤组织，并对其进行分化培养。此外，采用RAPD 和ISSR 分子标记技术对不同品种茭白及其愈伤组织进行基因组多态性分析，阐明茭白品种间的基因组多样性及组织培养过程中的无性系变异，探讨茭白愈伤组织分化与无性系变异间的关系，为茭白种质资源的研究及栽培品种的品质改良提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料取自中国计量学院生命科学学院温网室。选取了4 种茭白品种，其中3 个双季茭白品种：龙茭2 号、梭子茭、浙茭911，1 个野生茭白。以龙茭2 号茎部为材料诱导茭白愈伤组织。

1.2 试验方法

②茭白愈伤组织获得及继代培养 选择MS 和MB2 两种培养基进行茭白愈伤组织的诱导，以N6 培养基为愈伤组织的继代培养基。培养基配方如下。

a.MS 诱导培养基。MS 大量元素+MS 微量元素+IAA 1 mg/L+2，4-D 1 mg/L+VB11 mg/L+谷氨酰胺0.01%+琼脂0.9%+蔗糖40 g/L。

b.MB2 诱导培养基。MS 大量元素+MS 微量元素+VB51 ml/L+甘氨酸2 ml/L+谷氨酸146 mg/L+水解酪蛋白200 mg/L+蔗糖30 g/L+2，4-D 2 mg/L。

c.N6 继代培养基。N6+IAA 1 mg/L+2，4-D 1 mg/L+VB11 mg/L+谷氨酰胺0.01%+琼脂0.9%+白糖40 g/L。

③分化培养基筛选 通过查阅文献资料[9，10]，设计了不同激素成分及比例的分化培养基，进行愈伤组织的诱导分化。培养基配方及激素成分见表1。

④茭白DNA 提取纯化 以4 个品种茭白及2种茭白愈伤组织为材料，采用改良的CTAB 法提取DNA[11]。

表1 分化培养基配方

表2 2 种标记所用引物序列

⑤ISSR 和RAPD 扩增、检测 筛选获得适合茭白基因组多态性分析的ISSR 引物和RAPD 引物[12,13]，引物合成序列见表2。

反 应 体 系 如 下：10×PCR Buffer（Mg2++Plus）3 μL，dNTP Mixture(每个2.5 mmol/L）2 μL，cDNA 1 μL，Primer F（10 μmol/L）1 μL，Primer R（10 μmol/L）1 μL，LA Taq 0.25 μL，ddH2O Up to 25 μL。PCR 反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，35 个循环；72℃延伸10 min。所得的PCR 产物均用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分析。电泳结束后，使用Gene Genius Bio Imaging System 凝胶成像系统拍照。

1.3 试验数据及遗传分析

用筛选出的12 条ISSR 和7 条RAPD 引物对4 个品种茭白及2 种茭白愈伤组织进行扩增，按凝胶同一位置上DNA 条带的有无进行统计，有带的记为“1”，无带的记为“0”，统计汇总结果。

2 结果与分析

2.1 茭白愈伤组织获得及分化培养

①愈伤诱导 诱导获得了2 种不同类型的茭白愈伤组织（图1），一种愈伤组织呈绿色，颗粒致密；另一种愈伤组织呈淡黄色，颗粒松散。

②分化培养 经观察发现，7 种分化培养基培养表现有较大差异，其中NB、IB2 培养基在培养周期中增殖迅速，体积膨大较快，不分化生根；IZ、MT、IBZ 在培养周期中增殖迅速，一周左右就分化生根；MBA、IB 培养基在培养周期中增殖速度较缓慢，在培养的第二周缓慢分化生根。试验选用的分化培养基现阶段暂时未获得茭白幼苗（图2）。

2.2 扩增产物的多态性

利用RAPD 和ISSR 分子标记技术对4 个品种茭白及2 种茭白愈伤组织进行了基因组多样性分析，筛选出的12 条ISSR 和7 条RAPD 引物，共扩增出121 条清晰条带，其中包括20条多态性条带。结果见图3～5。

通过对DNA 多态性进行统计分析发现：20 条多态性条带中茭白品种材料多态性条带有4 条，愈伤组织多态性条带有16 条，多态性百分率分别为3.30%和13.22%。3 个正常茭白品种（梭子茭、龙茭2 号、浙茭911）之间并未检测到明显多态性，但是正常茭白与野生茭白之间存在一定的多态性，在19 条引物中，共有4 条引物检测到了多态性条带，占总条带数的比率为3.31%。通过对愈伤组织和龙茭2 号茭白植株样本进行了PCR 扩增，统计分析发现，在19 条引物中共有7 条对引物具有多态性条带，占总条带数的比率为11.57%，其中愈伤组织中缺失的条带有5 条，缺失条带对应的引物为ISSR1、ISSR3、UBC857。同时两种愈伤组织进行DNA 多态性统计分析发现在19 条引物中，共有6 条引物具有多态性， 占总条带数的比率为6.61%（表3，4）。

图1 茭白愈伤组织

图2 茭白愈伤组织分化培养

图3 ISSR1、ISSR3、S2049 扩增条带图谱

图4 ISSR2、ISSR17、A34、K13 扩增条带图谱

图5 S226、S327、S1049、S1060 扩增图谱

3 讨论与结论

茭白是由菰黑粉菌侵染野生菰植株后经过长期田间驯化筛选获得的无性系种墩，田间种植方式主要有薹管育苗和茭墩育苗，均为无性栽培方式。目前，茭白新品种选育的方法主要是通过田间茭墩无性系变异，筛选获得变异茭墩，进而通过田间筛选培育具有特色性状茭白品种[13,14]。无性系变异在茭白品种筛选及特性培育中具有重要作用。本研究诱导获得双季茭白龙茭2 号的2 种不同形态的愈伤组织，并进行了分化培养，初步筛选出茭白愈伤组织的诱导培养基及分化培养基。

植物组培无性系变异现象由Heinz 和Mee 首先提出，包括组培后代个体、器官或组织中出现的种种变异现象[15]，主要有生理因素、 遗传因素及生化因素等。植物组织培养中的体细胞无性系变异是植物组培后代中常见的现象，这种变异现象受植物种类、组织或器官特性、组织培养条件等影响[16]。 本试验基于ISSR 和RAPD 等DNA 分子标记比较分析了茭白栽培品种及愈伤组织的基因组多态性，发现组织培养中的无性系变异明显高于田间栽培的植株变异，正常茭白品种间的多态性低于正常茭白与野生茭白间的多态性，野茭无法结茭，而正常茭白茎部可以膨大成为可食用肉质茎[17]，野茭与正常茭白的形态差异可能与基因组多态性相关。但愈伤组织与茭白植株间的多态性很高， 在19条引物中共有7 条引物具有多态性条带， 占总条带数的11.57%。愈伤组织在分化阶段难以长成幼苗，有可能与相关条带的增加或缺失有关。此外诱导获得的2 种不同愈伤组织间也具有多态性，占总条带数的6.61%，表明组织培养过程中，2 种愈伤组织经历了不同无性系变异，导致形态差异明显。

表3 ISSR 引物扩增条带统计

表4 RAPD 引物扩增条带统计

植物组织培养产生的体细胞无性系变异通常是常规育种中不可能出现的变异。一个组织培养周期内可产生1%～3%的无性系变异几率[18,19]，远远高于自然突变频率，因此，研究无性系变异对茭白品种改良、选育新品种及植物基因型改良具有重要的指导意义。

[1] Terrell E E, Batra L R.Zizania latifoliaandUstilago esculenta,a grass-fungus association[J].Economic Botany 1982（36）:274-285.

[2]尤文雨，叶子弘，刘倩，等.我国茭白的生物学研究[J].长江蔬菜，2008（11）：35-38.

[3]俞晓平，李建荣，施建苗，等.水生蔬菜茭白及其无害化生产技术[J].浙江农业学报，2003，15（3）：109-117.

[4]Chan Y S,Thrower L B.The host-parasite relationship betweenZizania caducifloraTurcz.andUstilago esculentaP.Henn.structure and development of the host and hostparasite combination[J].New Phytologist，1980(l85):201-207.

[5]傅荣昭，邵鹏柱.DNA 分子标记技术及其在药用植物研究上的应用前景[J].生物工程进展，1998，18（4）：14-18.

[6]马文辉，何平.RAPD 标记在植物系统进化研究中的应用[J].西南师范大学学报：自然科学版，1999，24（4）：482-491.

[7]梁一池，杨华.植物组织培养技术的研究进展[J].福建林学院学报，2002，22（1）：93-96.

[8]齐春华.植物组织培养技术发展现状及方向[J].农业科技与装备，2011，202（4）：10-12.

[9]王文静，高松洁.植物组织培养的应用现状[J].河南师范大学学报，2000（3）：137-139.

[10]Negussic A.Induce more buds of junipers excelsa's tissue culture[J].For Ecol manage,1997,98(2):115-123.

[11]Liu G,Liu L W,Gong Y Q,et a1.Seed genetic purity testing of F1hybrid cabbage (Brassica oleraceavar．capitata) with molecular marker analysis [J]. Seed Sci＆Tech,2007,35 477-486.

[12]王述彬，罗向东，戴亮芳，等.辣椒细胞质雄性不育系与其保持系线粒体DNA 的RAPD 分析[J]．江苏农业学报，2008，24（1）：44-47.

[13]杜金昆，姚颖垠，倪中福，等.普通小麦、斯卑尔脱小麦、密穗小麦和轮回选择后代材料ISSR 分子标记遗传差异研究[J].遗传学报，2002，29（5）：445-452.

[14]王文静，高松洁.植物组织培养的应用现状[J].河南师范大学学报，2000（3）：137-139.

[15]Negussic A.Induce more buds of junipers excelsa's tissue culture[J].For Ecol Manage,1997,98(2):115-123.

[16]Skirvin M R,Janick J.Tissue culture-induced variation in scentedPelargoniumspp.[J].Amer Soc Hort Sci,1976,101(3):281-290.

[17]江解增，邱届娟，曹碚生，等.茭白膨大前后源库关系的研究[J].扬州大学学报：自然科学版，2001，4（4）：39-42.

[18]Heinz D J,M ee G W G.Morphologic cytogenetic and enzymatic variations in Saccharum species hybrld clones drived from callus culture[J].Amer J Bet,1971(58):257-262.

[19] Skirvin R M. Nature and induced variation in tissue culture[J].Euphtytica.,1978,(27):241-266.