婴儿双歧杆菌发酵培养的改进研究

沈颐涵

（上海信谊药厂有限公司制药总厂，上海201206）

0 引言

双歧杆菌是人体消化道内具有益生作用的优势菌群，迄今为止已发现的双歧杆菌有32种，其中分离自人体的有12种。双歧杆菌作为人体消化道中的原生菌以及其微生态制品所具有的特有性质，使其备受学术界和商界的关注[1]。

目前，可用于保健食品的双歧杆菌主要有5种：两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长型双歧杆菌、短双歧杆菌和青春双歧杆菌[2]。已见报道的双歧杆菌的生理功能包括：调整肠道菌群[3-4]、增强免疫系统[5]、防止便秘、降低结肠癌的发病率[6]、产生抗菌素[7]、提高蛋白质和维生素的代谢、缓解乳糖不耐症、治疗肝损伤、抗肿瘤、降低胆固醇[8]等。

双歧杆菌类产品主要有食品、保健品和药品等，而在此类产品的开发中，由于双歧杆菌对生存环境的要求较为苛刻，使其高密度培养成为限制工业化生产的瓶颈。因此，如何缩短培养时间并提高发酵液活菌数就成为了技术关键。在我厂目前的工艺条件下，婴儿双歧杆菌的发酵液活菌数为8.0×109cfu/g左右。

本研究通过优化发酵培养控制参数，旨在提高发酵液活菌量，为今后婴儿双歧杆菌的扩大培养和工业化应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

菌种：婴儿双歧杆菌（B.infantis）由上海信谊药厂有限公司药物研究所微生态制品研究室保藏。

培养基配方：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉10 g/L、牛肉膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、乳糖10 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、硫酸镁0.5 g/L、硫酸亚铁0.05 g/L、L-半胱氨酸0.25 g/L。

1.2 仪器设备

5 L发酵罐及配套系统（上海国强生化工程装备）；GQ75B高速管式离心机（上海浦东天本离心机械）；培养箱（Binder）；PHS-3E型精密pH计（上海雷磁）；Cary50紫外分光光度计（Varian）；BP3100S电子分析天平（Sartorius）；灭菌锅（Tony）；厌氧产气袋（梅里埃）。

1.3 试验方法

采用5 L发酵罐进行发酵研究，装罐量为3 L，分别研究发酵温度、发酵pH值、搅拌转速以及发酵时间对发酵液中活菌数量的影响，活菌量以lg活菌数值表示。

1.3.1 发酵液活菌数的测定

采用血琼脂平板计数法，梯度稀释至约菌数20～160个/mL后涂平板，置于（37±1）℃培养箱内进行厌氧培养48 h后计数。

1.3.2 发酵温度对发酵液活菌数的影响

婴儿双歧杆菌按质量分数10%接种量接入发酵罐培养，调节pH值为6.0，转速200 r/min，分别置于32℃、35℃、37℃、39℃、42℃温度下发酵10 h，发酵结束后放罐，检测发酵液活菌数。

1.3.3 发酵pH值对发酵液活菌数的影响

按照1.3.2所确定的最适合发酵温度，将婴儿双歧杆菌接种于pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的发酵培养基内，在转速为200 r/min的条件下发酵10 h，发酵结束后放罐，检测发酵液活菌数。

1.3.4 搅拌速度对发酵液活菌数的影响

按照1.3.2和1.3.3所确定的最适合发酵温度和pH值，将婴儿双歧杆菌分别在200 r/min、300 r/min、400 r/min、500 r/min、600 r/min的搅拌速度下发酵10 h，发酵结束后放罐，检测发酵液活菌数。

1.3.5 发酵时间对发酵液活菌数的影响

按照1.3.2、1.3.3和1.3.4所确定的最佳发酵参数，发酵婴儿双歧杆菌，每2 h取发酵液，分别测定其活菌数，绘制婴儿双歧杆菌的生长曲线，确定该菌的最佳发酵时间。

2 结果与分析

2.1 发酵控制参数的选择

2.1.1 发酵温度对发酵液活菌数的影响

发酵过程中，温度对微生物的生长有着较为重要的影响。一般提高温度，能够加速细胞分裂，使微生物的生长速度加快，但过高的温度会对微生物的生长起到抑制作用。本实验中，婴儿双歧杆菌按10%的接种量，在pH值6.0、搅拌转速200 r/min、温度分别为32℃、35℃、37℃、39℃、42℃的条件下厌氧发酵10 h，发酵液的活菌数结果如图1所示。

图1 不同发酵温度下发酵液的活菌数

图1 可以看出：发酵温度对双歧杆菌发酵液中活菌数的影响较为明显，且在不同的温度条件下，发酵液的菌落数存在差异。温度升高超过37℃后，婴儿双歧杆菌的生长速度并未有明显的提高。该菌株在37℃的条件发酵液中lg活菌数达到最高值9.38，折算成活菌数2.4×109cfu/mL，表明温度37℃为婴儿双歧杆菌的最适发酵培养温度。

2.1.2 pH值对发酵液活菌数的影响

在微生物发酵过程中，除了选择合适的温度外，维持发酵体系pH值的稳定也至关重要。本实验中，婴儿双歧杆菌按10%的接种量，在37℃、搅拌转速200 r/min、pH值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的条件下发酵10 h，发酵液的活菌数结果如图2所示。

图2 不同pH值条件下发酵液的活菌数

图2 可以看出：发酵培养的pH值对婴儿双歧杆菌发酵液中活菌数的影响明显，在pH6.5的条件下，发酵液菌体浓度最高，lg活菌数为9.77，折算发酵液活菌数约为5.84×109cfu/mL，表明pH值为6.5为婴儿双歧杆菌的最适发酵培养pH值。

2.1.3搅拌速度对发酵液活菌数的影响

婴儿双歧杆菌按10%的接种量，在37℃、pH值为6.5、搅拌转速分别为200 r/min、300 r/min、400 r/min、500 r/min、600 r/min的条件下发酵10 h，发酵液的活菌数结果如图3所示。

图3 不同搅拌速度条件下发酵液的活菌数

图3 可以看出：发酵罐的搅拌转速对婴儿双歧杆菌发酵液中活菌数的影响明显。搅拌转速提升，发酵液活菌数反而随之下降，这可能是因为婴儿双歧杆菌是厌氧菌，在发酵过程中需要厌氧环境。搅拌转速的增加，一定程度上增加了发酵体系中的溶解氧，使该菌株的生长环境发生变化所致。本实验在转速为200 r/min条件下发酵液的lg活菌数最高达到9.93，折算活菌数为8.33×109cfu/mL，表明婴儿双歧杆菌的最适搅拌转速为200 r/min。

2.1.4 发酵时间对发酵液活菌数的影响

婴儿双歧杆菌按10%的接种量，在37℃、pH值6.5、搅拌转速200 r/min的条件下，试验不同发酵时间的发酵液lg活菌数值，发酵液的活菌数结果如图4所示。

图4 不同发酵时间下发酵液的活菌数

图4 可以看出：在上述优化的实验条件下，发酵液的lg活菌数值在发酵前期随时间的延长而增长，在培养10～12 h后达到最高值，随后lg活菌数值增长缓慢。考虑到发酵液的lg活菌数在10 h之后变化不大，因此，选择发酵培养的时间为10 h较好。发酵10 h的结果显示，发酵液中活菌数可达约4.5×1010cfu/mL。

2.2 发酵控制参数的优化

为了确定其发酵培养的最佳控制参数，以发酵液的活菌数作为检测指标，通过单因素筛选获得的发酵控制参数设计正交试验如表1所示，以期最大限度提高婴儿双歧杆菌的发酵液活菌量。

表1 发酵控制参数设计的正交试验表

通过正交试验，分析试验结果（表2），综合考察最终选择最佳发酵控制参数方案为C1D2A2B2，即温度37℃、pH6.5、搅拌转速200 r/min、发酵时间10 h。

表2 试验结果分析

为验证正交试验结果的可靠性，采用上述优化控制参数进行试验，实际测得在优化发酵参数条件下，婴儿双歧杆菌的发酵液活菌量可达4.5×1010cfu/mL，表明正交试验所得出的最佳发酵控制参数可行。

3 结语

经过对婴儿双歧杆菌的培养温度、发酵pH值、搅拌转速以及培养时间的研究，优化筛选出了其最佳的发酵控制参数。与现有工艺相比，发酵菌体的得率能够提升约5.6倍。

本研究通过对婴儿双歧杆菌发酵特性的研究，有效提高了发酵液活菌浓度，为今后婴儿双歧杆菌的扩大培养和工业化应用提供了基础。

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