CYP2C19基因多态性与幽门螺杆菌阳性老年胃癌 患者的关系研究

徐俊丽，易福凌，刘永国，张明丽，吴松笛



论著·临床

CYP2C19基因多态性与幽门螺杆菌阳性老年胃癌 患者的关系研究

徐俊丽，易福凌，刘永国，张明丽，吴松笛

目的 研究CYP2C19基因多态性与幽门螺杆菌(HP)阳性老年胃癌患者的关系，探讨遗传因素在胃癌发病中的作用。方法 年龄>70岁的老年HP阳性患者150例，按照是否患有胃癌分为2组，HP阳性胃癌患者75例为观察组，HP阳性的非胃癌患者(包括胃溃疡、慢性胃炎等)75例为对照组，采用MassArraySNP方法检测2组CYP2C19 基因分型。结果 观察组患者CYP2C19基因分子为纯合子快代谢型、杂合子快代谢以及慢代谢型，三者发生率分别为33.3%、40.0%、26.7%；对照组以上3种类型分别为40.0%、45.3%、14.7%，观察组患者慢代谢型发生率较对照组高(χ2=9.284，P<0.05)。结论CYP2C19 的慢代谢型增加了老年HP阳性患者患胃癌的风险性，需要加强定期随访。

胃癌；细胞色素P450酶；CYP2C19；基因多态性

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.04.008

胃癌为我国常见的恶性肿瘤之一，在我国发病率居各类肿瘤的首位，胃癌的发生与许多遗传因子均相关，且包括肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)等。CYP2C19 是细胞色素P450酶的一种亚型，遗传学的改变使CYP450酶表现出遗传多态性，并且具有明显个体、种族或地域差异，从而导致蛋白质或酶的功能发生改变。CYP2C19 在前致癌物变成活化的致癌物方面发挥重要的作用，此外可能诱导环境致癌物的遗传易感性，但是具体的作用机制仍不明确[1，2]。已有研究表明CYP2C19基因多态性与食管癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌及白血病等多种肿瘤发生相关[3～7]。现探讨CYP2C19基因多态性与幽门螺杆菌(HP)阳性的老年胃癌患者的关系，为明确胃癌的病因以及预防提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年5月—2014年3月在我院住院确诊为HP阳性的原发性胃癌患者75例为研究组，男40例，女35例，年龄70～75(72.0±3.0)岁，肿瘤部位分别位于贲门、胃底以及胃体，基础性疾病包括高血压、冠心病、脑梗死等。HP阳性的非肿瘤患者(胃溃疡、慢性胃炎)75例为对照组，其中男40例，女35例，年龄69～73(71.0±2.9)岁。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属同意并签署知情同意书。

1.2 观测方法 清晨空腹抽取患者外周血2 ml，EDTA抗凝，-80℃保存。

1.2.1 引物设计： 根据基因的目标序列和选择的多态性位点，使用Sequenom Mass ARRAY Assay Design 3.0 软件(美国西格诺公司 )设计多重PCR特异性引物和单碱基延伸引物。对于rs4244285 位点(CYP2C19*2)，特异性扩增引物5’-ACGTTGGATGACTTTCTCCAAAATATCTG-3’，5’-ACGTTGGATGGCAATAATTTTCCCACTTT-3’，延伸引物 AGTAATTTGTTATGGGTT。对于rs4986893 位点(CYP2C19*3)， 特异性扩增引物 5’-ACGTTGGATGGACTGTAAGTGGTTTCTCG-3’， 5’-ACGTTGGATGAACATCAGGATTGTAAGG-3’，延伸引物为 TGGCCTTACCTGG。

1.2.2 CYP2C19基因型检测步骤：

1.2.2.1 PCR扩增反应 将384孔 PCR 板放在 384 孔冰板上，1个500 μl 离心管放在冰板上，-20℃取出融化，轻微震荡离心，混旋均匀后短暂离心，每孔 4 μl PCR Mix 加入 384 孔 PCR 板中，然后加入 1 μl 的 DNA 样品。膜封闭平板，混旋均匀后，常温4 000 r/min 离心 2 min。将 384 孔 PCR 板放入 PCR 仪中，进行 PCR 循环：用时约 140 min。95℃ 2 min ；45 个循环：95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，72℃ 5 min，4 ℃保存。

1.2.2.2 虾碱性磷酸酶(SAP)纯化 PCR 仪中取出样品平板，常温，4 000 r/min，离心 2 min，放置 384 孔冰板上。配置各种试剂，-20℃取出融化(酶使用前再从-20℃中取出，勿震荡)，轻微震荡离心备用。配制 SAP Mix，混旋均匀，离心后将 SAP 混合液加入到 PCR 反应体系中，每孔加入2 μl 混合液，使总体系达到7 μl。用封口膜封闭，涡旋混匀、常温4 000 r/min离心 2 min。按照以下条件进行 SAP 反应，用时约 50 min： 37℃ 40 min，85℃ 5 min，4℃循环。

1.2.2.3 单碱基延伸反应 从 PCR 仪中取出样品平板，常温，4 000 r/min，离心 2 min，放置 384 孔冰板上备用。-20℃取出融化后，轻微震荡离心备用。混旋均匀，离心后将 UEP Mix 分装至新的 384 孔反应板中，每孔加入2 μl，使总体系达到9 μl。用封口膜封闭，混旋均匀，常温4 000 r/min 离心2 min。进行单碱基延伸反应，用时约 240 min。

1.2.2.4 树脂交换 将树脂倒在平板上，对应相应进行反应的孔，用玻璃平板反复推拉压实， 去除并回收多余树脂，干燥 10 min。从 PCR 仪中取出样品平板，常温，4 000 r/min，离心 2 min，放置于室温。在样品平板上进行反应的孔中加入16 μl 的纯净水，混旋均匀，4 000 r/min 离心 5 min。小心将样品平板倒扣在树脂板上，压紧并反转，轻敲树脂平板，让树脂全部落入样品平板中。用封口膜封闭样品平板，在静音混悬器上混悬 15 min。在离心机上4 000 r/min 离心 5 min。

1.2.2.5 质谱检测 准备好的样本板放入 MassArray 点样仪，进行点样。将点好样本的芯片放入 MassArray 质谱仪，进行质谱检测。在数据服务器上通过 Typer 4.0 软件进行分析

2 结 果

2.1 基因分型CYP2C19*2基因分3型，分别为CYP2C19*1/*1 (野生型2*GG)、CYP2C19*1/*2 (纯合突变2*GA)、CYP2C19*2/*2(杂合突变2*AA)；CYP2C19*3基因分3型，分别为CYP2C19*1/*1 (野生型3*GG)、CYP2C19*1/*3 (纯合突变3*GA)、CYP2C19*3/3(杂合突变3*AA)。2个位点的基因结果均为GG，则为纯合子快代谢；GG+GA、GG+AA、GA+GA为杂合子快代谢型，GA+AA或AA+AA为慢代谢。各基因型特征性质谱图见图1～5(因CYP2C19*3AA基因型较少，本文未绘制其质谱图)。

图1 CYP2C19*2的AA基因型典型质谱图

2.2 基因型构成 观察组患者CYP2C19分为纯合子快代谢型、杂合子快代谢型及慢代谢型，三者发生率分别为33.3%、40.0%、26.7%，对照组分别为40.0%、45.3%、14.7%，观察组患者的慢代谢型发生率明显较对照组高，差异有统计学意义(χ2=9.284，P<0.05)。

图2 CYP2C19*2的GG基因型典型质谱图

图3 CYP2C19*2的GA基因型典型质谱图

图4 CYP2C19*3的GG基因型典型质谱图

图5 CYP2C19*3的GA基因型典型质谱图

3 讨 论

亚洲地区胃癌发病率比较高，纯合子快代谢型、杂合子快代谢型以及慢代谢型这3种基因型在亚洲国家的分布频率分别为30%～40%，40%～50%和14%～22%，而在欧美等国家则分别为70%～75%，20%～25%以及2%～5%[8～10]。这些数据表明慢代谢型基因有可能会促进胃癌的发生，与本结果一致，可能CYP2C19的慢代谢型与胃癌的发生密切相关。

胃癌的病因迄今尚未完全阐明，大量研究资料表明胃癌的发生是多种因素综合作用的结果，外界因素包括胃通过饮食与外界接触，某些致癌因素可发挥致癌作用。如N-亚硝基化合物以及幽门螺杆菌感染等，此外真菌、毒素可以诱发大鼠胃腺癌或胃的癌前病变。国内外许多研究表明幽门螺杆菌感染与胃癌的发生密切相关，根除幽门螺杆菌后胃癌的发病率明显下降[11]，因此对于具有胃癌高危因素的慢代谢型的HP阳性患者，应该进行正规的除菌治疗。

目前国内外关于CYP2C19与肿瘤的关系研究较多，发现CYP2C19的慢代谢者在不同肿瘤的发生率不同。目前认为其主要机制有：CYP2C19参与前致癌物的活化，主要代表为膀胱癌，CYP2C19参与了致癌物质的灭活；慢代谢者与食管癌、肺癌以及胃癌的发生具有相关性，推测当CYP2C19酶活性减弱时，这些致癌物在体内代谢减慢，导致其在体内堆积，增加了致癌物在体内的浓度以及作用时间，从而增加了肿瘤的易感性[12～14]。日本有学者对幽门螺杆菌感染者进行调查，发现慢代谢者患胃癌的风险性较高[15]。目前国内对于老年HP阳性胃癌患者的基因检测相对较少，本次研究结果提示CYP2C19 的慢代谢型增加了老年HP阳性患者患胃癌的风险性，可能与其参与了致癌物的灭活相关，具体与哪些致癌物灭活相关，需要进一步的研究。对于此类HP阳性患者我们需要加强定期随访以减少发病率及病死率。

总之，本次研究探讨了CYP2C19的基因分型与老年胃癌发病的关系，但因样本量有限，结果仍有其局限性，对HP阴性的胃癌患者未进行检测，需要在今后的研究中进一步证实。

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Relationship between the CYP2C19 gene polymorphism and gastric cancer in old patients with helicobacter pylori infection

XUJunli*,YIFuling,LIUYongguo,ZHANGMingli,WUSongdi.

*DepartmentofGeriatrics,Xi’anFirstHospital,ShanxiProvince,Xi’an710002,China

Objective To investigate the relationship between CYP2C19 gene polymorphism and helicobacter pylori (HP) positive elderly patients with gastric cancer, also investigate the effect of genetic factors in the pathogenesis of the di-sease.Methods 150 cases of aged >70 years old HP positive patients were enrolled, according to whether suffered from gastric cancer, they were divided into 2 groups, HP positive gastric cancer patients of 75 cases as the observation group, HP positive without gastric cancer patients (including gastric ulcer, chronic gastritis) of 75 cases as control group, using the MassArray SNP method to detect the CYP2C19 genotyping of the 2 groups.Results Observation groups’ CYP2C19 gene type were homozygous with fast metabolism, heterozygous fast metabolism and slow metabolism, the incidence were 33.3%, 40.0%, 26.7% respectively; the control group’s incidence were 40.0%, 45.3%, 14.7% respectively, the incidence of slow metabolic type in the observation group was higher than the control group (χ2=9.284,P<0.05).Conclusion CYP2C19’s slow metabolism type increases the risk of gastric cancer in elderly patients with positive HP, regular follow-up should be strengthen.

Gastric cancer; Cytochrome P450 enzyme;CYP2C19；Gene plymorphism

陕西省自然科学基金资助项目(No.2013JC2-14)； 西安市卫生局科研基金项目(No.2013-07)

710002 西安市第一医院老年病科消化肿瘤病区(徐俊丽、刘永国、张明丽、吴松笛)，检验科(易福凌)

2014-12-24)