肉鸭重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re—6株）母源抗体消长规律及免疫程序研究

摘要：选取1 d健康无免疫肉鸭480羽，随机分成A、B、C、D 4组，每组120羽。B组、C组、D组在10 d分别免疫0.5、0.8、1.0 mL H5N1亚型禽流感（Re-6株）灭活疫苗，A组为非免疫对照组。用HI方法检测母源抗体、免疫抗体，根据母源抗体、免疫抗体消长规律，探讨H5N1亚型禽流感（Re-6株）灭活疫苗的合理免疫程序。结果显示：7 d之前，鸭群中90%以上的个体HI效价在4 log2及以上，获得的母源抗体可以有效保护鸭群；14 d时，鸭群仅有56.7%的个体有保护性抗体；21 d还能够检测到极低的母源抗体，鸭群中6.7%的个体有一定的保护力；28 d之后，鸭群所有个体的HI效价均在4 log2以下，鸭群已经丧失对禽流感病毒的抵抗力。

关键词：肉鸭；H5N1高致病性禽流感；母源抗体；免疫抗体；消长动态；免疫程序；血凝抑制试验

中图分类号： S852.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0216-02

收稿日期：2014-02-23

基金项目：河南省科技攻关项目（编号：122102110022）。

作者简介：马超锋（1981—），男，河南禹州人，硕士研究生，兽医师，主要从事重大动物疫病防控研究。E-mail：machaofeng5@163.com。河南省信阳地区河网密布，非常适合养殖鸭鹅等水禽。近年来，信阳地区养鸭业发展迅猛，饲养量、存栏量逐年增长。肉鸭因其具有饲养周期短、成本低、出栏早等优点，养殖规模在信阳市各县区逐步扩大。目前，全市肉鸭存栏量已达1 800万羽，年出栏量达5 000万羽，均居河南省首位。随着肉鸭养殖业的发展，鸭病尤其是病毒性疾病（鸭瘟、鸭病毒性肝炎、鸭副黏病毒等）流行日趋严重，特别是禽流感对肉鸭养殖业的打击几乎是毁灭性的。禽流行性感冒简称禽流感（avian influenza，AIV），是由禽流感病毒引起的1种人畜禽共患的传染病。AIV根据其对家禽致病力的不同分为3种，即高致病性、低致病性、无致病性。H5N1高致病性禽流感病毒（HPAIV）是严重危害禽类的病原之一，对人类健康威胁较大，该亚型禽流感病毒是目前发现的禽流感病毒中感染性最强、致死率最高、流行范围最广的病毒，已在多个国家发生流行，给养殖业带来了巨大的经济损失[1-2]。现阶段，疫苗接种仍是我国控制禽流感的主要措施之一[3]。根据农业部及河南省畜牧局的要求，信阳地区从2012年5月开始，使用H5N1新型禽流感Re-6株疫苗对水禽进行防疫[4]。养殖户在饲养周期内何时免疫高致病性禽流感疫苗、剂量多少，国内尚无相关研究。为探讨重组禽流感病毒灭活疫苗（H5NI亚型，Re-6株）对肉鸭的免疫效果，根据国家强制免疫计划及前人的研究，本研究采用不同剂量疫苗对相同日龄肉鸭进行免疫接种，并监测抗体的消长规律，以制定合理的肉鸭免疫程序，旨在为预防、控制禽流感提供参考。

1材料与方法

1.1材料

重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-6株）由辽宁益康生物股份有限公司提供，批号：20130801。禽流感H5亚型（Re-6株）血凝抑制试验诊断抗原（批号：2013005）、禽流感H5亚型（Re-6株）阴阳性血清（批号：2013004）。采集2～3羽无禽流感及新城疫等抗体的健康公鸡自行配制1%鸡红细胞悬液。1日龄健康无免疫肉鸭480羽（河南省潢川县华英集团某饲养场专人饲养）。将雏鸭随机分成A、B、C、D 4组，每组120羽，A组为非免疫对照组，其余各组均为试验组。B组、C组、D组于10日龄分别免疫0.5、0.8、1.0 mL重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-6株）。

1.2仪器

Eppendorf 10～1 000 μL单道移液器及25～300 μL多道移液器（德国Eppendorf公司），303系列电热恒温培养箱（上海树立仪器仪表有限公司），TDZ5-WS台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

1.3方法

1.3.1采样A、B、C、D 4组分别在1、7、14、21、28、35、42日龄通过翅静脉采血，每组随机抽取30羽采其血样，每羽1～2 mL，分离血清后冷冻保存备检。

1.3.2检测采用血凝（HA）及血凝抑制试验（HI）进行禽流感抗体检测，按照GB/T 18936—2003 《高致病性禽流感诊断技术》规定的方法进行。禽流感病毒血凝试验抗体检测方法判定标准：以完全抑制4单位抗原的最高血清稀释倍数为该血清的HI效价。当阳性对照血清的HI效价与已知效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清的HI效价不高于2 log2时，试验方可成立。被检血清HI效价≤3 log2判为阴性；效价=4 log2判为可疑（可疑样品应重检，重检效价≥4 log2 判为阳性，≤3 log2判为阴性）；效价≥5 log2判为阳性。

1.4数据处理

采用算术平均数表示HI效价，采用抗体合格率表示群体免疫合格情况，群体免疫抗体阳性率达到70%判定为群体合格。采用one-way ANOVA分析差异显著性。

2结果与分析

2.1不同日龄肉鸭H5N1亚型禽流感（Re-6株）灭活疫苗母源抗体检测情况

由表1可知，雏鸭母源抗体效价在1 d最高，平均值达 66 log2，保护力较好；随着日龄增加，母源抗体开始下降，至14 d，HI平均值为3.87 log2，保护作用大大降低；28 d鸭群基本无母源抗体，已起不到保护作用。

2.2不同日龄肉鸭H5N1亚型禽流感（Re-6株）灭活疫苗保护性母源抗体群体合格率

由图1可见，雏鸭1 d时，抗体合格率为96.7%；7 d时90%的个体达到保护要求；14 d时，30羽雏鸭中11羽抗体效价在4log2以下，抗体合格率下降至56.7%；21 d时只有2羽在4log2以上，鸭群保护率为6.7%；28 d以后，整个鸭群无有效禽流感保护性抗体。endprint

2.3H5N1亚型禽流感（Re-6株）灭活疫苗试验组不同日龄肉鸭免疫抗体消长情况

由图2、图3可见，B组、C组、D组HI效价均值及抗体合格率均在14 d达到最低值，此后逐渐上升。对B组、C组、D组的HI效价均值进行生物统计分析，P=0.468>0.05，差异不显著；对B组、C组、D组的抗体合格率进行生物统计分析，P=0.665>0.05，差异不显著，就数值而言C组稍好。

3结论与讨论

3.1肉鸭H5N1亚型禽流感（Re-6株）灭活疫苗母源抗体消长规律

研究表明，种鸭产生的免疫抗体可以通过卵黄传递给雏鸭，起到天然被动免疫的作用，保护雏鸭免受禽流感病毒的侵袭[5]。当HI效价≥4 log2时，可以保护鸭体免受禽流感野毒感染。本研究表明，7 d之前，鸭群中90%以上的个体HI效价在4 log2及以上，获得的母源抗体可以有效保护鸭群；14 d时，鸭群仅有56.7%的个体有保护性抗体；21日龄还能够检测到极低的母源抗体，鸭群中6.7%的个体有一定的保护力；28 d之后，鸭群所有个体的HI效价均在4 log2以下，鸭群已经丧失对禽流感病毒的抵抗力。

3.2肉鸭H5N1亚型禽流感（Re-6株）灭活疫苗免疫程序

重组禽流感病毒灭活疫苗（H5NI亚型，Re-6株）是农业部兽医局根据病毒流行病学监测情况、疫苗评估结果以及专家评审意见授权疫苗厂家生产的用于防控水禽禽流感的产品。家禽日龄及品种不同，对疫苗免疫的敏感性也不一致，HI抗体产生的时间、所能达到的高度及维持的时间也存在差别[6]。鸭的高致病性禽流感免疫一般需要2次免疫才能得到较高的免疫抗体[7]。由于肉鸭饲养周期短，45～60 d就出栏，免疫时机、剂量选择显得尤为重要。本研究表明，试验期间3个试验组的HI效价均值均在4 log2以上，0.8 mL组及 1 mL 组的抗体合格率都在70%以上，10 d对肉鸭注射 0.8 mL 疫苗是比较合理的免疫程序。本试验中，禽流感抗体水平一直偏低，鸭群中个体达到9 log2或10 log2滴度的很少，一方面可能与鸭对重组禽流感病毒灭活疫苗（H5NI亚型，Re-6 株）敏感性较低有关，另一方面与水禽血清中可能存在某种非特异性的凝集因子对鸡红细胞有非特异性凝集作用有关[8]。禽流感对鸭群危害极大，一旦发病，会造成巨大的经济损失。为提高禽流感疫苗对肉鸭的免疫效果，建议采取以下措施：疫苗的免疫接种要严格按照说明书进行，免疫注射时，要轻逮轻放；提高禽群的免疫力、抗应激能力，免疫前后，给禽群的饮水或饲料中添加黄芪多糖、植物血凝素、蜂灵散等免疫促进剂促进鸭群免疫应答，添加适量的电解多维等营养性药物以提高禽群抗应激能力[9]；加强对防疫人员的培训，确保免疫效果、免疫密度。

参考文献：

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[5]何芳兴. 樱桃谷肉鸭禽流感母源抗体消长规律研究及最佳首免日龄的探讨[J]. 福建畜牧兽医，2008，30（1）：9.

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[7]卫龙兴，俞财荣，王福泉，等. 白羽肉鸭高致病性禽流感疫苗免疫效果研究[J]. 现代农业科技，2009，21：263-264.

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[9]张济培，陈建红，刘佑明，等. 白鸭禽流感H5亚型疫苗免疫促进剂的筛选[J]. 中国兽医杂志，2012，48（7）：27-29.何伟忠，王成，严淑云，等. 交城和墨玉骏枣氨基酸组成的比较分析[J]. 江苏农业科学，2015，43（2）：291-293.endprint