栀子全国生产区划中指标成分多波长HPLC方法建立

苗琦等

摘要：以梔子为研究对象，建立了多波长高效液相色谱法对栀子中京尼平苷酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、绿原酸、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ等 6种有效成分的测定方法，并将此方法应用于不同产地栀子成分含量的测定，为栀子全国生产区划提供了可靠指标。

关键词：HPLC；栀子；生产区划

中图分类号： O657.7+2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0300-03

收稿日期：2014-09-17

基金项目：国家科技支撑计划（编号：2011BAI04B01）；中央本级重大增减支项目（编号：20603020110、20603020213）；江西中医药大学校级研究生创新专项（编号：JZYC14C09）。

作者简介：苗琦（1989—），男，陕西宝鸡人，硕士研究生，主要从事中药资源开发与应用研究。E-mail：miaoqi6213963@126.com。

通信作者：罗光明，博士，教授，主要从事中药资源开发与应用研究。Tel：（0791）7118982；E-mail：jzlgm11@163.com。栀子是茜草科常绿灌木植物栀子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥成熟果实，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒的功效。栀子主要生长在长江以南各省，主产于江西省、湖南省、湖北省、浙江省等地，是江西省道地药材，也是市场上广泛销售的大宗药材。中药区划研究中药资源及其地域系统的空间分异规律，对特定环境下药材的适生性进行评价，并以适当的方式表示出来，它是选择中药材引种栽培适生地的基本依据[1-2]。不同地区间中药资源的差异性是中药区划的前提。中药区划研究中通常选取有效成分含量等可以定量化的要素作为区划指标[1]。2010年版《中国药典》中只对中药栀子中的栀子苷这一有效成分进行了明确规定，但中药成分的复杂性决定了单一成分或指标难以客观评价中药质量，只将栀子苷单一成分含量作为栀子药材的区划指标是无法对栀子进行生产区划的。栀子苷并不能代表栀子药材的所有药效，栀子中主要含有环烯醚萜苷类、西红花苷类、有机酸等化合物，主要有效成分包括京尼平苷酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、绿原酸、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ。其中栀子苷具有抗炎、解热、利胆、轻泻的作用；京尼平苷酸具有抗肿瘤、抗氧化的作用；京尼平1-β-D龙胆二糖苷能改善戊巴比妥钠引起的心力衰竭；绿原酸具有显著的抗癌及保肝利胆作用；西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ是西红花和栀子中共有的色素类成分，具有去黄疸、利胆及明显的降血脂作用[3]。本研究以栀子为对象，建立了多波长高效液相色谱法测定对栀子中京尼平苷酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、绿原酸、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ 等6种有效成分的方法，旨在为栀子区划提供更加合理可靠的指标。1材料与方法

1.1仪器

Waters高效液相色谱仪，Empower工作站（美国Waters公司），BP224S电子天平（万分之一）（北京赛多利斯仪器系统有限公司），KQ-300E超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

1.2材料

甲醇色谱纯（美国天地有限公司）；乙腈色谱纯（美国ACS公司）；甲醇分析纯（西陇化工股份有限公司）；娃哈哈纯净水；标准品：京尼平苷酸（111828-201102，纯度按 96.0%计算）、绿原酸（110753-201314，纯度按96.6%计算）、栀子苷（110749-201316，纯度按97.5%计算）、西红花苷-Ⅰ（111588-201202，纯度按91.1%计算）、西红花苷-Ⅱ（111589-201304，纯度按92.4%计算）购于中国药品生物制品检定所，京尼平1-β-D龙胆二糖苷（批号为ZM0501BA14，纯度>98.0%）购于上海源叶生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1供试品溶液的制备称取0.1 g栀子粉末（过4号筛）置具塞锥形瓶中，加入75%甲醇25 mL，称定质量，超声处理40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤。量取续滤液10 mL，置于25 mL容量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀即得。

1.3.2对照溶液的制备称定适量各对照品，分别置于 50 mL 棕色容量瓶中，用适量75%甲醇溶液溶解并定容至刻度，分别制成含京尼平苷酸10.176 μg/mL、京尼平1-β-D龙胆二糖苷201.292 μg/mL、绿原酸4.443 6 μg/mL、栀子苷311.61 μg/mL、西红花苷-Ⅰ 175.276 4 μg/mL、西红花苷-Ⅱ 17.371 2 μg/mL的对照品储备液。

1.3.3色谱条件Durashell C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）；梯度洗脱：0～18 min（8%～15% A）；18～25 min（15%～23% A）；25～40 min（23%～35% A）；40～50 min（35%～50% A）；检测波长：238、330、440 nm；柱温：30 ℃；流速：0.8 mL/min；进样量：10 μL。

2结果与分析

2.1对照品溶液、供试品溶液多波长HPLC分析

分别得到238 nm（图1）、330 nm（图2）、440 nm（图3）下对照品、样品的HPLC色谱图，与相应对照品色谱峰保留时间及紫外光谱图进行比对，确认了6个色谱峰的归属。

由此可知，京尼平苷酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、栀子苷在238 nm处有最大吸收波长；绿原酸在330 nm处有最大吸收波长；西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ在440 nm处有最大吸收波长。故将238、330、440 nm定为6种有效成分的检测波长。

2.2线性关系考察

将“1.3.2”节的混合对照品储备液，分别用75%甲醇稀释2、4、8、16、32、64倍，按“1.3.3” 节的色谱条件测定，进样10 μL，以进样量10 μL中对照品质量（μg）为横坐标，最佳检测波长下的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果见表1。

2.3方法学考察

2.3.1精密度试验取稀释2倍的混合对照品溶液10 μL，在“1.3.3”节的色谱条件下，连续进样5次，测定峰面积。栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、绿原酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、京尼平苷酸的RSD分别为0.55%、0.50%、041%、0.48、0.49%、0.54%，表明仪器精密度良好。

2.3.2稳定性试验取稀释2倍的混合对照品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，测定峰面积，栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅰ、绿原酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、京尼平苷酸的RSD分别为1.21%、1.33%、097%、174%、1.51%、1.82%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.3重复性试验取同一批药材，按“1.3.1”节的方法平行处理5份，同法制成供试品溶液，测定峰面积，栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、绿原酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、京尼平苷酸的RSD分别为1.36%、1.89%、0.59%、130%、0.77%、1.43%，表明此法重复性良好。

2.3.4加样回收率试验称取已知含量的样品，共5份，加入2 mL混合对照品溶液，按照“1.3.1”节的方法制备供试品溶液，按照“1.3.3”节的色谱条件，进样10 μL，依次测定6种有效成分的峰面积并计算平均加样回收率，平均回收率分别为99.32%、99.48%、99.19%、99.34%、99.51%、99.65%，表明此方法回收率较好。

2.3.5样品的含量测定按“1.3.1”节的方法制备12个不同产地的栀子样品，经0.45 μm有机滤头过滤后进样10 μL，按“1.3.3”節的色谱条件，根据标准曲线计算栀子中6种有效成分的含量，结果见表2。

3结论与讨论

3.1提取方法的选择

本研究采用了20、30、40、50、60 min提取时间下回流、超声2种提取方法，综合分离度、峰形、峰数目、峰面积、重复性等因素，结果表明，回流40 min与50、60 min提取效果几乎无差异，回流40 min为最佳回流提取时间；超声 40 min与超声50、60 min提取效果也几乎无差别，提示超声40 min为最佳超声提取时间；超声40 min与回流40 min提取效果几乎一致，但由于回流重复性较差，同法制备样品RSD较超声高出很多，而且超声较回流操作方法简单，故选择超声40 min为样品的提取方法。

3.2流动相的选择

试验过程中尝试了甲醇-水、乙腈-水等体系，比较了在水中加入磷酸或甲酸峰形、分离度的差别，在确定流动相后，尝试了多个梯度洗脱方法，结果表明，乙腈分离效果较甲醇更好，而且随着乙腈比例的增加，保留时间显著缩短，但分离度有所下降；加入磷酸或者甲酸使溶剂体系呈弱酸性，能改善峰形、分离度，但磷酸、甲酸之间并无明显差别。

3.3检测波长的选择

大多数研究人员采用254 nm或者其他单一波长作为栀子成分的检测波长，由于中药成分复杂，采取单一检测波长会出现峰组成单一、峰面积普遍偏小以及特征峰数量少等情况，后续的栀子指纹图谱相似度计算也无法客观反映栀子药材的成分。栀子中主要含有环烯醚萜苷类、有机酸类、西红花苷等化合物。本试验使用DAD检测器对样品进行190～500 nm 全波长扫描，并对各波长下的色谱进行分析。结果表明，3类化合物的最佳检测波长分别是238、330、440 nm。中药成分的复杂性决定了单一成分或指标难以客观评价中药质量，如果只选取单一波长进行检测，可能造成峰面积信息丢失或残缺，所以本试验选择238、330、440 nm作为检测波长，各峰分离良好，特征峰明显且峰形较好，3个波长图谱最大可能地获取了色谱组分信息。

3.4不同产地栀子中6种有效成分的含量

本研究表明，不同产地的栀子中均含有栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、京尼平苷酸，部分产地栀子中由于绿原酸含量极少无法检出，不同产地栀子中各成分含量既有相似之处，也存在很大的差别。栀子苷含量最高，其次含量较高的是西红花苷-Ⅰ、京尼平1-β-D龙胆二糖苷等。各成分的含量范围波动较大，这可能是由于不同地区的土壤、气候、水分、矿物质分布情况、药材采收期及药材种源等都会对中药材质量产生影响。各地不同的自然生态环境条件直接影响生物的种类、数量、形态结构、生理功能等，自然生态环境与中药资源的质量、数量密切相关[4]。

参考文献：

[1]张小波，郭兰萍，周涛，等. 关于中药区划理论和区划指标体系的探讨[J]. 中国中药杂志，2010，35（17）：2350-2354.

[2]郭兰萍，黄璐琦，蒋有绪，等. 2种不同模式中药适宜性区划的比较研究[J]. 中国中药杂志，2008，33（6）：718-721.

[3]孟祥乐，李红伟，李颜，等. 栀子化学成分及其药理作用研究进展[J]. 中国新药杂志，2011，20（11）：959-967.

[4]徐燕，曹进，王义明，等. 多波长高效液相色谱法同时测定栀子中的三类成分[J]. 药学学报，2003，38（7）：543-546.李敏，王自健，路喆，等. 不同产地薰衣草H-701精油理化性质比较[J]. 江苏农业科学，2015，43（2）：303-306.